科研产出
Real-Time PCR方法对IBV弱毒苗致弱分析
《山东农业科学 》 2015
摘要：在前期研究中,对QX基因型IBV分离株SDZB0808在SPF鸡胚连续传代前后毒株(P1和P100)进行全基因组测序。针对P1和P100毒株基因组的差异,设计特异性引物,利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量检测方法对其进行定量分析。结果显示:该野毒株强、弱基因并存,经鸡胚传代后,强毒毒株所占比例逐步下降,弱毒毒株所占比例逐步上升,相对值呈下降趋势,接近于零。从而推测:传染性支气管炎病毒致弱原因可能是鸡胚对弱毒基因的定向选择性筛选的结果。
关键词： 鸡传染性支气管炎 Real-Time PCR IBV弱毒苗 致弱
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我国口蹄疫流行血清型RT-PCR鉴别诊断技术的建立
《中国病原生物学杂志 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：目的建立口蹄疫流行株不同血清型RT-PCR的鉴别诊断技术,为有效防控口蹄疫提供技术支撑。方法根据GenBank中的A型、O型、Asia1型口蹄疫病毒的全基因组核酸序列,用Primer 5.0设计该3型口蹄疫病毒的通用引物及特异性分型引物,建立RT-PCR方法,采用1%琼脂糖凝胶电泳结合测序技术对引物的特异性和广谱性进行分析。结果 1%琼脂糖电泳结果表明通用引物P1/P2能同时特异性扩增A、O、Asia1型口蹄疫病毒,扩增片段大小为457bp,与预期值相一致。A、O、Asia1型分型引物只能扩增相应亚型口蹄疫病毒的目的基因片段(大小分别为320、240和460bp),与预期值相一致。不能扩增其他2种亚型。Blast比对显示分型引物扩增产物序列经测序验证与其亚型完全对应,同源性为84%~99%。结论建立的RT-PCR诊断技术对口蹄疫病毒通用型扩增具有广谱性,对基因亚型分型具有特异性,可用于口蹄疫病检测及其流行病学调查。
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花生FUSCA3基因的克隆与表达分析
《核农学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：为了挖掘花生品质性状相关功能基因,本研究以花生品种花育17号为试材,根据c DNA文库中已知的FUSCA3基因全长序列设计引物,通过RT-PCR克隆到该基因,命名为Ah FUSCA3。Ah FUSCA3全长为1 532 bp,开放阅读框ORF为1 134 bp,对应的基因组序列3 892 bp,由6个外显子和5个内含子组成,内含子剪接方式符合GT-AG剪接规则。根据编码区预测Ah FUSCA3编码一条378个氨基酸组成的多肽,预测分子量为42.3 k D,等电点为5.58。预测该基因编码的蛋白含有B3保守结构域,可能定位于细胞核中。蛋白序列比对和进化树分析表明,花生与大豆(Glycine max)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)和苜蓿(Medicago truncatula)等豆科植物中的FUSCA3序列相似性最高,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,Ah FUSCA3基因表达量在花生荚果、种子发育的过程中呈现先增后降的趋势,推测Ah FUSCA3基因在花生胚胎形成和发育过程中发挥重要作用。本研究为阐明花生胚胎发育过程和油脂代谢机制提供了理论基础,为花生品质改良育种提供了新的基因资源。
猪IL-10 SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测方法的建立
《家畜生态学报 》 2014 北大核心
摘要：白介素-10(IL-10)是一种具有免疫抑制作用的多能细胞因子.能够引发猪免疫抑制效应的多种病毒在感染宿主时均伴随有明显的IL-10上调,其中就包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),然而并不是所有的PRRSV毒株都能上调IL-10.为了详细探讨PRRSV免疫抑制与IL-10上调之间的关系以及PRRSV感染上调IL 10的具体分子机制,本研究针对猪IL-10以及看家基因β actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建了各自含有IL-10、βactin引物扩增序列的重组质粒为阳性标准品,建立了以2△△ct为基础的SYBR GreenⅠrealtime PCR检测方法.该方法线性关系良好;敏感性高,两种基因的检测下限均为1×101 copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性良好,批内变异系数小于2%,批间变异系数小于3%;目的基因及内参基因的扩增效率较高,分别为92.7%、97.8%.综上所述,该方法可以用于猪IL-10 mRNA水平的表达分析.
关键词： 猪 白介素-10 PRRSV 免疫抑制 Real-time PCR
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核桃WRKY4基因的克隆与表达分析
《核农学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：WRKY转录调控因子广泛参与植物的生长发育、生物胁迫和非生物胁迫等生理过程。本研究利用reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)及rapid amplification of cDNA ends(RACE)技术克隆了核桃(Juglans regia L.)WRKY基因cDNA全长序列,命名为WRKY4(GenBank登录号为KC795551.1)。结果表明,克隆到的片段长度为2 174 bp,完整开放阅读框为1 554 bp,编码517个氨基酸。序列分析表明WRKY4基因含有2个WRKY保守结构域和2个C2H2锌指结构域,属于WRKY基因家族第Ⅰ类成员。利用实时荧光定量PCR分析4℃低温和自然低温条件对该基因表达的影响以及组织表达模式。结果表明WRKY4受低温诱导表达,能够在低温胁迫的早期响应这一生理过程。WRKY4在树皮(韧皮部)、雌花、花芽和叶片中均有表达,且在树皮中表达量最高,具有组织特异性。研究结果可为核桃抗寒基因工程育种提供基因资源。
关键词： 核桃 WRKY转录因子 基因克隆 实时荧光定量PCR
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甜樱桃病毒病分子检测技术的研究
《果树学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：【目的】建立简便、快速、高效、准确的甜樱桃病毒分子检测方法。【方法】根据我国甜樱桃病毒病害的发生特点,先后建立和完善了几种主要病毒的单重RT-PCR、多重RT-PCR、纳米磁珠技术结合多重RT-PCR的检测方法,并对各检测方法的适用范围、检测效率进行比较分析。【结果】改进后的单重RT-PCR方法利用随机引物反转录得到的c DNA模板可同时用于多种病毒的特异性检测。多重RT-PCR方法可在同一管PCR反应中同时检测多种病毒。运用纳米磁珠技术结合多重RT-PCR的检测方法在植物病毒核酸提取环节简化了操作程序。【结论】该检测技术体系已应用于山东地区甜樱桃及中国樱桃等大批量植物样本的病毒检测工作之中,检测结果稳定、可靠。
关键词： 甜樱桃 病毒 检测 RT-PCR 多重RT-PCR 纳米磁珠
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花生中UDP-葡萄糖基转移酶基因的克隆及在非生物胁迫下的表达研究
《中国油料作物学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：通过RACE技术从花生叶片cDNA中克隆到了UDP-葡萄糖基转移酶的基因,命名为AhUGT83A1-like(GenBank注册号为KF411463)。该基因全长为1 530bp,ORF为1 380bp,编码460个氨基酸。序列比对与进化分析结果表明,该序列有保守的UDPGT结构域,并且与其它植物的UGT蛋白同源性较高。荧光定量PCR结果表明,AhUGT83A1-like基因在高盐和低温处理的花生根和叶片中均上调表达;在干旱处理时,根中表达也受到显著上调,但叶片中表达量则有明显下降。以上结果表明AhUGT83A1-like可能参与了花生对干旱、低温和高盐的抗性调控。ABA处理结果表明,AhUGT83A1-like在花生根中对ABA响应明显,但在叶片中对ABA没有明显响应,表明该基因在花生根中对非生物胁迫的调控可能是以依赖ABA的方式发挥作用的。
关键词： 花生 AhUGT83A1-like 基因克隆 非生物胁迫 荧光定量PCR
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猪IL-10 SYBR Green I Real-time PCR检测方法的建立
《家畜生态学报 》 2014 北大核心
摘要：白介素-10(IL-10)是一种具有免疫抑制作用的多能细胞因子。能够引发猪免疫抑制效应的多种病毒在感染宿主时均伴随有明显的IL-10上调,其中就包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),然而并不是所有的PRRSV毒株都能上调IL-10。为了详细探讨PRRSV免疫抑制与IL-10上调之间的关系以及PRRSV感染上调IL-10的具体分子机制,本研究针对猪IL-10以及看家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建了各自含有IL-10、β-actin引物扩增序列的重组质粒为阳性标准品,建立了以2-△△Ct为基础的SYBR GreenⅠrealtime PCR检测方法。该方法线性关系良好;敏感性高,两种基因的检测下限均为1×101copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性良好,批内变异系数小于2%,批间变异系数小于3%;目的基因及内参基因的扩增效率较高,分别为92.7%、97.8%。综上所述,该方法可以用于猪IL-10mRNA水平的表达分析。
关键词： 猪 白介素-10 PRRSV 免疫抑制 Real-time PCR
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花生果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因AhFBA1的克隆与表达
《作物学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：以花生品种花育33为试材,根据cDNA文库中已知的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase,FBA)基因全长序列设计引物,通过RT-PCR克隆到该基因,命名为AhFBA1。AhFBA1全长为1489 bp,开放阅读框为1200 bp,编码400个氨基酸。预测该基因编码的蛋白含有Glycolytic保守结构域,可能定位于叶绿体中。蛋白序列比对和进化树分析表明,花生与大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago truncatula)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)和菜豆(Phaseolus vulgaris)等豆科植物中的FBA序列相似性最高,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,在高盐和干旱胁迫下,AhFBA1在花生叶和根中的表达均受明显诱导,说明该基因可能参与花生对高盐和干旱胁迫的适应性调控;AhFBA1在花生根和叶中均受ABA的明显诱导,说明该基因对花生非生物胁迫的调控可能是依赖ABA的。
关键词： 花生 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 克隆 系统发育分析 非生物胁迫 荧光定量PCR
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花生AhSOS2基因的克隆及功能初探
《作物学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：SOS2(Salt Overly Sensitive 2)作为植物中一类重要的耐盐相关基因,在调控细胞内离子平衡及参与植物对盐害的响应及适应过程中具有重要作用。本研究通过RACE的方法,从花生叶片中分离到一长1462 bp、包含1341 bp开放阅读框(ORF)的cDNA片段,生物信息学分析显示,该基因属SOS2类基因,被命名为AhSOS2(GenBank登录号为HG797656),编码446个氨基酸,为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。对基因表达特性的荧光定量PCR分析显示,AhSOS2在花生中为组成型表达;且受盐胁迫及干旱诱导。经250 mmol L–1 NaCl处理后,该基因在花生幼苗茎中被诱导表达,表达量约是对照茎中的30倍;而在30%PEG-6000模拟干旱处理下,该基因在花生幼苗叶中表达量也明显升高。综合以上结果,显示AhSOS2可能参与并调控花生对逆境的抗性及耐受性。目前,已成功构建了AhSOS2的植物双元表达载体pCAMBIA1301P-AhSOS2并获得转基因植株,初步功能分析显示,过表达AhSOS2基因的转基因水稻对盐胁迫的耐受性提高。预期这方面的工作对于解析花生对盐害、干旱等逆境的适应及防御机制,进而指导花生抗性育种及品质改良具有重要意义。
关键词： 花生 SOS2类基因AhSOS2 荧光定量PCR 表达特性 抗逆 品质改良
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