科研产出
2021-2022年山东省猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查
《畜牧与兽医 》 2023 北大核心
摘要：为研究2021—2022年猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在山东地区的流行情况，从疑似发病的猪场采集了103份临床样本，采用RT-PCR方法对样品进行检测，并对阳性样品进行GP5和NSP2基因的序列测定、遗传进化分析以及同源性分析。结果显示：103份样品中检测到21份阳性样品，阳性率为20.38%。最终有5个样品能够同时扩增出GP5和NSP2基因序列，遗传进化分析显示，这5个样品中有2个属于谱系（lineage）1;2个属于lineage 5;1个属于lineage 8。各样品之间GP5基因的核苷酸同源性为81.5%～99.3%,NSP2基因的核苷酸同源性为56.9%～99.4%。本研究表明2021—2022年山东地区的PRRSV传播呈现多样性，为PRRSV毒株的遗传变异、演化分析和防控提供了理论基础。
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 同源性 流行病学 遗传变异 进化分析
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猪TRIM56敲除细胞系的构建及在增殖PRRSV疫苗毒株中的应用
《畜牧与兽医 》 2023 北大核心
摘要：利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建 1 株猪TRIM56 基因敲除的PAM-KNU细胞系,并探究其在增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)疫苗毒株中的应用.根据猪TRIM56 基因组外显子区域设计合成2 对特定的向导RNA引物,将引物磷酸化、退火并连接至Px459M和EZ-Guide-XH载体构建敲除质粒Px459M-sTRIM56-KO;将敲除质粒转染PAM-KNU细胞,经嘌呤霉素筛选、有限稀释法筛选获得单克隆细胞并扩大培养;通过RT-PCR、测序及Western blot筛选鉴定,最终获得了敲除细胞系sTRIM56-KO-PAM-KNU;将PRRSV R98 疫苗株感染野生型细胞及敲除细胞系,利用real-time RT-PCR、半数组织培养感染量(TCID50)以及Western blot 检测PRRSV增殖情况.结果显示,TRIM56 敲除细胞系构建成功,该敲除细胞系中sTRIM56 基因编码区第 929~2120 位 1192 个碱基缺失,未检测到sTRIM56 蛋白条带;敲除细胞系中PRRSV R98 疫苗株病毒拷贝数、病毒滴度以及N蛋白表达均显著高于对照组.本研究为猪TRIM56 抗病毒机制研究及PRRSV疫苗研发奠定了基础.
关键词： 猪TRIM56基因 基因敲除 PAM-KNU细胞 猪繁殖与呼吸综合征病毒
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1株基因重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的新型变异和遗传进化分析
《中国兽医学报 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：对山东省某地区初诊为猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproduction and respiatory syndrome,PRRS)的猪病料采用RT-PCR进行鉴定,获得1株PRRSV并命名为SD18.对该分离株的第2代细胞培养毒株进行全基因组测序,与其他参考毒株比较同源性并构建遗传进化树.结果显示,SD18毒株属于美洲型高致病性PRRSV变异株,该毒株Nsp2基因具有31个不连续的氨基酸缺失,已明显区别于以JXA1、HUN4、TJ株等为代表的30个不连续缺失高致病性分离株,其中第830位氨基酸位点是最新发现的缺失氨基酸.同时,该毒株的ORF3基因第17位插入1个丝氨酸(S),而ORF5基因编码的第13位和第151位氨基酸均为具有强毒特性的精氨酸(R),第137位则插入了具有野毒特性的丝氨酸(S),这4个氨基酸位点也表现出不同于以往高致病性毒株变异的特征.采用基因重组分析软件RDP4分析表明,该新型缺失株的多个部位发生了基因重组;SD18毒株病毒以美洲经典毒株VR2332作为重组的主要亲本毒株,疫苗株JXA1-R和新型毒株NADC30-like提供重组片段,多数重组变化集中在Nsp2蛋白区域,在非结构蛋白和次要蛋白区域也可见部分重组变化.本研究为深入探索PRRSV的遗传变异规律及相关生物学特性研究积累了数据.综合分析表明,山东地区SD18分离株Nsp2、GP3、GP5相应氨基酸均出现了较大变异,特别是Nsp2出现一个新的氨基酸缺失,可能是该毒株形成了一个新的独立变异分支的重要原因;这些变异也提示该分离毒株在病毒编码蛋白及其免疫原性等方面出现了较大变化.该病毒株的成功分离鉴定与遗传进化分析为PRRSV衍化及流行病学调查积累了最新数据,也为预防控制该病提供参考.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 变异毒株 遗传衍化 Nsp2基因 基因重组
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山东及周边部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的变异与遗传演化分析
《畜牧兽医学报 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：为了解中国山东及周边部分地区自2017年以来猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株的分子流行病学特征、基因组变化规律,作者收集来自山东省、河南省和江苏省的部分猪场采集及送检的疑似PRRS症状猪组织样品70份,利用RT-PCR方法对其进行PRRSV检测。对部分阳性病料中PRRSV的基因重组、决定中国高致病性PRRSV(HP-PRRSV)致病性和复制力的Nsp9第561、586和592位氨基酸等进行分析,以探明该区域PRRSV的遗传演化规律。结果显示,PRRSV检出率为55.7%,从上述样品筛选11株PRRSV分离株。Nsp2序列分析显示,与经典美洲毒株VR-2332相比,7株PRRSV分离株的Nsp2蛋白分别在第481及533-561位发生了30个氨基酸的不连续缺失,这与我国自2006年以来流行的HP-PRRSV的缺失特征相同;2株PRRSV分离株的Nsp2蛋白在481、533-561及595-597位发生了三个部位的共33个不连续氨基酸的缺失;2株PRRSV分离株的Nsp2蛋白在475-518及533-561位出现了两个部位的共73个不连续氨基酸的缺失。该研究中PRRSV分离毒株的Nsp2基因已发生了明显的新型缺失。采用基因重组分析软件RDP4分析显示,以上后4株新型缺失株存在较大的基因重组,且重组部位和重组片段数量不相同;4株病毒均以高致病性毒株JXA1作为重组的主要亲本毒株,多数重组变化集中在Nsp2蛋白区域,在其他非结构蛋白和次要蛋白区域也可见部分重组变化。另外,Nsp9第561、586和592位氨基酸变异分析显示,该4株病毒在上述三个氨基酸位点与中国HP-PRRSV相符。本研究为深入探索PRRSV的遗传变异规律及相关生物学特性研究积累了数据。
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 Nsp2基因 Nsp9基因 新型缺失 基因重组
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2015-2017年山东地区CSFV、PRRSV和PRV的流行病学调查与分析
《中国兽医学报 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：为了解山东地区生猪主要病毒性疾病的发生情况,掌握疫病发生及变化规律。本试验对2015-2017年山东省各生猪养殖场送检的病料和血清进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)3种病原抗原和抗体检测及遗传演化分析。结果显示:2015-2017年CSFV平均抗原阳性率为9.99%,抗体水平逐年提高,平均抗体阳性率为79.38%;样品序列测定结果显示,目前CSFV的主要流行毒株为2.1d亚型。PRRSV平均抗原阳性率为41.44%,平均抗体阳性率为83.28%,2015-2017年PRRSV抗原和抗体水平均趋于平稳趋势。2017年PRV平均抗原阳性率12.30%,gE平均抗体阳性率为30.95%,gB平均抗体阳性率为74.70%,2017年PRV野毒感染的风险有所提高。结果表明,虽然部分病毒性传染病的发生发展出现一些变化及风险,但仍处于可防可控的范围。该调查分析结果可为山东地区CSFV、PRRSV和PRV的流行和防控提供参考。
关键词： 流行病学调查 猪瘟病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒 伪狂犬病病毒
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华东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查
《中国兽医杂志 》 2018 北大核心
摘要：为了解华东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株变异情况,本研究以RT-PCR技术对山东、福建发病猪场的41份组织样品进行PRRSV检测和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)相关毒株(HP-PRRSVLike)检测,对阳性样品进行PRRSV分离、ORF5基因测序及变异分析。结果显示,福建、山东样品的阳性率分别为56%、74%;共分离到16个美洲型毒株(福建10株、山东6株),分属于Lineage 8、Lineage 5、Lineage 3、Lineage 1四个谱系,其中以Lineage 8为主。这表明PRRSV流行毒株多样化,跨谱系毒株重组值得警惕。
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5 序列分析
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国家自然科学基金资助猪繁殖与呼吸综合征病毒研究情况分析
《畜牧兽医学报 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：对1995年以来国家自然科学基金委员会(National Natural Science Foundation of China,NSFC)资助猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)研究的情况进行分析。统计分析表明1995—2016年NSFC对PRRSV资助的项目数呈整体上升趋势,特别是2008—2015年增幅最明显。项目依托单位以高等院校为主体,其中获资助项目数量最多的是华中农业大学,获资助经费总额最多的是中国农业大学。此外,NSFC资助PRRSV的研究以兽医传染病学为主,在所有的128个项目中,获得两次及两次以上项目资助的负责人主持的项目数占总项目数的43.8%。发表的SCI论文涵盖了PRRSV的遗传与变异、复制、致病机制、免疫机制、综合防控等方面,标志着我国科学家在NSFC资助下PRRSV研究已经达到国际领先水平。
关键词： 国家自然科学基金委员会 猪繁殖与呼吸综合征病毒 资助项目
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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5抗体检测ELISA在中和抗体评估中潜在应用的研究
《中国预防兽医学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：为评估猪群血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)中和抗体水平,本研究以原核表达的重组HP-PRRSV GP5蛋白为包被抗原,通过对反应条件进行优化,建立了检测GP5抗体的间接ELISA(r GP5-ELISA)。结果显示该方法与猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、细小病毒、日本乙型脑炎病毒阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。重复性试验结果显示,组内组间变异系数均小于5.3%。应用建立的r GP5-ELISA方法和IDEXX-ELISA对288份临床血清样品进行检测,结果显示两种方法具有较低的相关性(R=0.831)。中和试验(SN)结果显示,r GP5-ELISA检出阳性血清的中和效价显著高于IDEXX-ELISA(p<0.01)。Western blot复检r GP5-ELISA检测呈阴性的65份猪血清样品,其中58份呈阴性、7份为阳性;而IDEXX-ELISA检测则该65份血清全部呈阳性。对比SN和western blot试验,r GP5-ELISA比商品化IDEXX-ELISA具有更高的SN抗体符合率,因而其检测结果能够更好地反映猪群血清中和抗体水平。本研究建立的方法可以用于大规模猪群PRRSV中和抗体水平评估,并为PRRS流行病学调查提供了技术支持。
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 囊膜糖蛋白5 间接ELISA 中和抗体水平评估
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猪IL-10 SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测方法的建立
《家畜生态学报 》 2014 北大核心
摘要：白介素-10(IL-10)是一种具有免疫抑制作用的多能细胞因子.能够引发猪免疫抑制效应的多种病毒在感染宿主时均伴随有明显的IL-10上调,其中就包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),然而并不是所有的PRRSV毒株都能上调IL-10.为了详细探讨PRRSV免疫抑制与IL-10上调之间的关系以及PRRSV感染上调IL 10的具体分子机制,本研究针对猪IL-10以及看家基因β actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建了各自含有IL-10、βactin引物扩增序列的重组质粒为阳性标准品,建立了以2△△ct为基础的SYBR GreenⅠrealtime PCR检测方法.该方法线性关系良好;敏感性高,两种基因的检测下限均为1×101 copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性良好,批内变异系数小于2%,批间变异系数小于3%;目的基因及内参基因的扩增效率较高,分别为92.7%、97.8%.综上所述,该方法可以用于猪IL-10 mRNA水平的表达分析.
关键词： 猪 白介素-10 PRRSV 免疫抑制 Real-time PCR
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