科研产出
猪IL-10 SYBR Green I Real-time PCR检测方法的建立
《家畜生态学报 》 2014 北大核心
摘要：白介素-10(IL-10)是一种具有免疫抑制作用的多能细胞因子。能够引发猪免疫抑制效应的多种病毒在感染宿主时均伴随有明显的IL-10上调,其中就包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),然而并不是所有的PRRSV毒株都能上调IL-10。为了详细探讨PRRSV免疫抑制与IL-10上调之间的关系以及PRRSV感染上调IL-10的具体分子机制,本研究针对猪IL-10以及看家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建了各自含有IL-10、β-actin引物扩增序列的重组质粒为阳性标准品,建立了以2-△△Ct为基础的SYBR GreenⅠrealtime PCR检测方法。该方法线性关系良好;敏感性高,两种基因的检测下限均为1×101copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性良好,批内变异系数小于2%,批间变异系数小于3%;目的基因及内参基因的扩增效率较高,分别为92.7%、97.8%。综上所述,该方法可以用于猪IL-10mRNA水平的表达分析。
关键词： 猪 白介素-10 PRRSV 免疫抑制 Real-time PCR
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基因调控型质粒串联表达猪α、γ干扰素及其体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性研究
《畜牧与兽医 》 2013 北大核心
摘要：利用兔β-Globin Intron II基因调控序列,改造真核表达载体pVAX1,构建基因调控型质粒,将猪α干扰素(pIFN-α)和γ干扰素(pIFN-γ)进行串联表达。结果表明,重组质粒pMVAX1-pIFN-α/γ表达的IFN活性相比pVAX1-pIFN-α提高了100倍,比pVAX1-pIFN-γ提高了1 000倍。体外抗病毒活性表明,pIFN-α/γ的量为100 U(稀释度1∶106)以上时,对100 TCID50的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)具有明显的抑制效果,说明串联表达的pIFN-α和pIFN-γ具有高效抗PRRSV效果。本研究将为PRRS的预防治疗提供新的思路和方法。
关键词： 猪α干扰素 猪γ干扰素 猪繁殖与呼吸综合征病毒 抗病毒活性
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PRRS流行毒株与减毒活疫苗TJM-F92株qPCR区分方法的建立与应用
《家畜生态学报 》 2013
摘要：为快速准确区分PRRS流行毒株与减毒活疫苗TJM-F92株以及对流行毒株进行定量检测,按GenBank中发表的美洲型PRRSV SX-1分离株、弱毒疫苗株NSP2基因缺失部位的不同设计了一对特异性引物,通过RT-PCR和体外转录的方法,构建了体外转录RNA作为标准品,并对反应条件和反应体系进行优化,旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性和稳定性良好的qPCR鉴别方法。结果表明,该方法最低能检测出1.0×101拷贝/μL的模板,敏感性比常规PCR高100倍;应用该方法对218份临床样本进行鉴别与定量,qPCR检出率较常规RT-PCR高12.9个百分点。研究表明,qPCR鉴别方法的建立实现了对PRRS流行毒株与疫苗毒株的快速区分以及对流行毒株的定量检测,为PRRS的快速诊断提供了依据。
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征 qPCR 体外转录 Nsp2基因
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鲁中地区猪高热性疾病的病理变化及病原学调查研究
《畜牧兽医学报 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：为研究鲁中地区猪高热性疾病的病理变化及主要发病原因,对2011年1月-2012年3月患高热性疾病的56个患病猪群109头病猪进行了临诊症状及剖检病变观察,并对发病猪群进行追踪调查,采集363份发病猪群的血清,用ELISA方法检测血清样品的CSFV、PRRSV及PCV2抗体,用RT-PCR和PCR方法检测病料中这3种病原,并对病料进行病理组织学及免疫组化检测。结果显示:患高热性疾病的猪群均已免疫过CSF、部分免疫过PRRS弱毒活疫苗,但均未进行PCVD疫苗免疫;发病猪群的CSF、PRRS及PCV2均有较高的抗体阳性率;病猪以淋巴组织急性炎症、间质性肺炎、病毒性脑炎的病变为主,其病变率分别为92.3%、76.1%和66.1%;CSFV、PRRSV和PCV2的病原检出率分别为30.27%、66.97%、41.28%,其中CSFV与PRRSV、CSFV与PCV2、PRRSV与PCV2二重感染检出率分别为16.51%、6.42%、28.44%,三者共感染检出率为4.59%,8.26%的病料未检测到这3种病原,属其它病原感染所致。序列分析表明CSFV流行株正在向着远离猪瘟兔化弱毒疫苗的方向发展,PRRSV均为高致病性变异毒株,PCV2则为毒力较强的PCV2b型。CSFV、PRRSV、PCV2是目前导致鲁中地区猪高热性疾病的主要病原,其中以PRRSV变异强毒感染最为常见,共感染是导致重症型猪高热性疾病的主要原因,病例还多见支原体、副猪嗜血杆菌等细菌病继发感染的病变,故该区域猪高热性疾病为多病原混合感染所致。
关键词： 猪瘟 猪繁殖与呼吸综合征 猪圆环病毒病 病理变化 病原学
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猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP检测方法的建立
《家畜生态学报 》 2011
摘要：研究针对美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守的N蛋白基因设计了4条LAMP的检测引物,通过优化反应条件,建立了一种检测PRRSV的LAMP诊断方法。特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测美洲型PRRSV,其最低检测限为1×101个拷贝,而常规PCR的最低检出限为1×105个拷贝。判定检测结果时不需要借助昂贵仪器设备,仅需加入1μL橙红色核酸染料就可以进行判断,颜色变绿判定为阳性,仍保持为橙红色判定为阴性。LAMP可以快速、直观、准确地检测PRRSV,是一种适合猪场现地应用的检测方法。
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 LAMP 核酸染料 现地检测
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山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子特征
《家畜生态学报 》 2011
摘要：为揭示2009~2010年山东地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子特征,通过RT-PCR扩增采自山东地区不同猪场病猪组织样本中PRRSV的Nsp2、ORF5、ORF6、ORF7序列,用DNAStar软件分析所测序列,并与北美洲型VR-2332株、欧洲型LV株及国内分离株进行核苷酸和推导的氨基酸同源性比较。结果表明,Nsp2、ORF5、ORF6、ORF7核苷酸与北美洲型VR-2332的同源性分别为77%~79.9%、88.3%~89.6%、94.9%~95.8%、93.3%~94.1%,与欧洲型LV株的同源性分别为29.6%~31.6%2、64.1%~64.8%、68.3%~68.6%、66.2%~67.3%,证明山东地区的PRRSV毒株仍属北美洲型。系统进化分析表明它们与国内2006~2010年间的分离株(变异株)亲缘关系较近,而与更早的分离株和疫苗MLV株亲缘关系较远,未发现传统毒株。在Nsp2、ORF5、ORF6、ORF7基因上均有不同程度的点突变。本研究揭示了山东地区流行的PRRSV各基因的变异特征,为PRRSV的综合防控提供理论依据。
关键词： PRRSV Nsp2基因 ORF5基因 ORF6基因 ORF7基因 序列分析
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多重RT-PCR检测PRRSV和CSFV及PRRSV ORF5基因遗传变异分析
《中国兽医学报 》 2011 北大核心 CSCD
摘要：根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的基因组序列设计了2对特异性引物,建立了同时检测PRRSV和CSFV的多重RT-PCR方法。2008年1月至2009年12月期间,采集山东各地71个不同规模猪场及农村散养户212份病料,采用建立的多重RT-PCR技术同时检测PRRSV和CSFV的感染状况。检测结果显示,病料中高致病性PRRSV占57.1%(121/212),CSFV占29.2%(62/212)。应用RT-PCR方法扩增山东不同地区16株PRRSV的ORF5基因,并进行了序列分析。结果表明,16株PRRSV的ORF5基因核苷酸同源性为97.0%~100.0%;与参考变异毒株JXA1、传统毒株VR2332核苷酸同源性分别为98.0%~99.5%和86.4%~87.7%。推导的氨基酸序列分析表明,16株毒株GP5蛋白氨基酸不存在缺失,但存在位点突变。12株在非中和表位29位点与准种进化34位点发生了突变,分别由V→A和N→S;1株在非中和表位185位点发生突变,由A→V;这与2007年流行的PRRSV毒株JXA1、HUN等不同。
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪瘟病毒 多重PCR ORF5基因
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猪繁殖与呼吸综合征病毒SX-1株N蛋白单克隆抗体的制备
《家畜生态学报 》 2011
摘要：用纯化的重组HIS标签N蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体(McAb),经细胞融合获得5株可分泌特异性McAb的抗PRRSV N蛋白的杂交瘤细胞1A12,3F11,5A3,5F9,4E4。其中1A12,3F11,5A3,4E4杂交瘤上清与HIS-N蛋白与GST-N蛋白两种抗原包被的ELISA反应均为阳性。5F9与HIS-N蛋白包被的ELISA反应为阳性,而与GST-N蛋白包被的ELISA反应呈阴性。单抗1A12,3F11,4E4,5A3与HIS-N与GST-N蛋白的Western blotting反应均为阳性,而5F9只与HIS-N反应。IFA检测显示1A12,3F11,5A3,4E4株单抗都有明显的荧光,说明其与PRRSV呈阳性反应。同时,ELISA检测又有很好的特异性。
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白 单克隆抗体
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PRRSV分离株Nsp2基因和ORF5基因的遗传变异分析
《家畜生态学报 》 2011
摘要：为了解山东省PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2007~2009年分离到的14株山东省内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和ORF5基因序列的测定和分析。结果显示,与参考毒株JXA1相比,14株PRRSV Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到96.1%~99.8%和98.0%~99.8%,氨基酸序列同源性分别达到92.9%~100%和97.5%~99.5%。序列分析结果表明,14株毒株在Nsp2蛋白内部均存在编码30个氨基酸的碱基对的不连续缺失;ORF5基因编码的GP5蛋白不存在缺失,但存在点突变。遗传进化分析表明,07年分离毒株JQ与参考毒株JXA1亲缘关系很近;09年分离的12株PRRSV,2株仍与国内2006~2007年间的分离株在同一分支,9株已经处在不同分支,1株单独处在一个分支。2007~2009年山东地区流行的PRRSV分离株具有年度特征,无明显的地域特征。
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 分离 Nsp2基因 ORF5基因 变异分析
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PRRSV山东变异缺失株SX-1的全基因序列分子特征分析
《中国兽医学报 》 2011 北大核心 CSCD
摘要：对从山东某发病猪场采集的猪繁殖与呼吸综合征疑似病料中分离到的PRRSV病毒(SX-1株),应用RTPCR方法分段扩增出PRRSV SX-1毒株的各基因片段,扩增后的产物分别克隆于pMD-18T载体鉴定后测序。序列号GQ875656。序列分析结果表明SX-1株基因组全长15 320nt(不包括poly尾),包含9个开放阅读框,5′UTR长189 nt,3′UTR长150 nt;SX-1株在分子遗传演化上属于PRRSV变异毒株,与参考毒株JXA1的核苷酸同源性为98.9%;与CH-1a和VR2332的同源性为94.8%和89.5%;而与LV的同源性仅为59.3%。基因系统发育树分析结果显示,SX-1与JXA1、GDBY1株的亲缘关系很近,与CH-1a亲缘关系较近,与VR2332、CC-1、RespPRRS/Repro MLV等毒株处于不同的分支。
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