科研产出
禽类三种常见病原菌快速检测体系的建立及应用
《山东农业科学 》 2021
摘要：鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌是禽类3种常见的革兰氏阴性致病菌。为实现3种病原菌的快速检测,选择各自的保守基因ompA、phoA和fimW,建立并优化了同时鉴定3种病原菌的多重PCR方法。3个引物对的最佳终浓度分别为0.60、0.28、0.20μmol/L,最佳退火温度为57℃;该方法能从其他7种临床常见病原菌中特异性区分出鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌;在DNA水平和菌水平的最低检测限分别达到1 pg/μL和104 cfu/mL。本试验建立的多重PCR方法特异性和敏感性好,检测成本低、效率高,适用于禽类常见3种临床重要病原菌单一或混合感染的快速诊断及流行病学调查。
关键词： 鸭疫里默氏杆菌 大肠杆菌 沙门氏菌 多重PCR 快速检测
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PCV2、PRV、PPV多重PCR检测方法的建立及其应用
《家畜生态学报 》 2019 北大核心
摘要：根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)有关基因序列,通过序列比对及参考相关文献,设计了3对特异性引物。通过优化,建立了可同时检测PCV2、PRV及PPV 3种病毒的多重PCR方法。结果表明,该方法能同时检测到PCV2、PRV及PPV的最低核酸量分别为40pg、72pg、46pg。对猪圆环病毒3型(PCV3)、猪细环病毒(TTSuV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)无扩增。应用该方法对87份临床样品进行检测,PCV2阳性检出率为28.7%(25/87),PRV野毒检出率为11.5%(10/87),PPV检出率为12.6%(11/87)。其中2种以上病毒混合感染阳性率为13.8%(12/87),3种病毒同时感染的阳性率为2.3%(2/87),其结果也与单一PCR结果一致。研究结果提示,该方法可用于PCV2、PRV、PPV三种病原的单一感染或混合感染的鉴别诊断。
关键词： 猪圆环病毒2型 猪伪狂犬病毒 猪细小病毒 多重PCR
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鸭病毒性肝炎病毒、禽流感病毒和新城疫病毒三重PCR诊断方法的建立及应用
《中国兽医学报 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：根据GenBank中已登录的鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)的基因序列,设计了3对特异性引物,建立了DHV、AIV和NDV的多重PCR鉴别诊断技术,并对体系进行了优化和特异性、敏感性试验。结果表明,该体系所扩增的3种病毒基因片段大小分别为174bp(DHV)、264bp(AIV)和362bp(NDV),且特异性、敏感性良好,能够分别检出1pg AIV、10pg DHV和10pg NDV的病毒RNA。对鸭临床样品的检测结果表明,该方法与病毒分离鉴定符合率90%以上,可用于临床样品的快速检测。
关键词： 多重PCR 鸭病毒性肝炎病毒 禽流感病毒 新城疫病毒
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高效检测板栗群体基因频率方法的建立
《果树学报 》 2011 北大核心 CSCD
摘要：以17个板栗群体为试材,采用ABI全自动遗传分析仪,利用5’端荧光标记的SSR引物,通过混合样本中PCR产物检测峰高与丰度对应,分析基因频率,建立板栗群体混合样本等位基因及其频率的分析方法。与聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法相比,ABI全自动遗传分析仪的检测灵敏度高,荧光引物CmTCR10(NED)共检测到78个等位基因,平均每个群体4.6个;引物CmTCR24(6-FAM)检测到41个等位基因,平均每个群体2.4个。多重PCR荧光SSR检测结果显示,可以明确区分不同的等位基因。荧光SSR能准确地读出片段大小,定量PCR扩增产物的丰度。用GeneScan获取数据,用Genotyper软件对数据进行设置与输出,使用R软件的FREQS-R模块,初步探讨利用荧光SSR定量化数据,计算供试群体混合样本的等位基因频率,可通过荧光SSR产物的丰度来确定混合取样群体的基因频率。
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多重RT-PCR检测PRRSV和CSFV及PRRSV ORF5基因遗传变异分析
《中国兽医学报 》 2011 北大核心 CSCD
摘要：根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的基因组序列设计了2对特异性引物,建立了同时检测PRRSV和CSFV的多重RT-PCR方法。2008年1月至2009年12月期间,采集山东各地71个不同规模猪场及农村散养户212份病料,采用建立的多重RT-PCR技术同时检测PRRSV和CSFV的感染状况。检测结果显示,病料中高致病性PRRSV占57.1%(121/212),CSFV占29.2%(62/212)。应用RT-PCR方法扩增山东不同地区16株PRRSV的ORF5基因,并进行了序列分析。结果表明,16株PRRSV的ORF5基因核苷酸同源性为97.0%~100.0%;与参考变异毒株JXA1、传统毒株VR2332核苷酸同源性分别为98.0%~99.5%和86.4%~87.7%。推导的氨基酸序列分析表明,16株毒株GP5蛋白氨基酸不存在缺失,但存在位点突变。12株在非中和表位29位点与准种进化34位点发生了突变,分别由V→A和N→S;1株在非中和表位185位点发生突变,由A→V;这与2007年流行的PRRSV毒株JXA1、HUN等不同。
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪瘟病毒 多重PCR ORF5基因
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猪流感病毒低密度分型芯片的试验研究
《西南农业学报 》 2011 北大核心 CSCD
摘要：根据猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)H1N1、H3N2、H5N1和H9N2亚型的血凝素(HA)基因序列,分别设计各亚型的特异引物,并根据A型流感病毒的M基因序列设计引物,作为4种病毒亚型的通用引物。应用RT-PCR分别扩增各病毒亚型HA基因的特异片段和M基因片段,并克隆到pMD19-T Simple Vector构建重组质粒,经测序后,用于各病毒亚型探针的制备。将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上,制备成低密度基因芯片。在多重PCR过程中,用生物素标记的dUTP(Bio-11-dUTP)对待检样品进行标记,扩增产物与制备的基因芯片进行杂交,最后用扫描仪进行读片和分析。结果表明,该方法可以同时检测4种SIV病毒亚型,与PCR方法相比,显示了较高的灵敏度。该方法的建立,为SIV分型和猪流感疫情的监测提供了一种快速、灵敏和高通量的手段。
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禽四种病毒多重PCR诊断技术的建立和应用
《家畜生态学报 》 2011
摘要：根据禽呼肠孤病毒(ARV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的基因保守区设计了4对特异性引物,建立了针对四种病毒的多重PCR检测体系,并对该体系进行了条件优化及特异性、敏感性试验。该体系扩增的四种病毒基因片断大小分别为199bp(ARV)、264bp(AIV)、362bp(NDV)和459bp(IBV),且特异性、敏感性良好,能够检出1pg AIV和10pg ARV、NDV、IBV的RNA。临床应用结果证明,该体系具有很高的实用价值和应用前景。
关键词： 多重PCR 禽呼肠孤病毒 禽流感病毒 新城疫病毒 鸡传染性支气管炎病毒
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多重PCR诊断猪细小病毒、伪狂犬病毒和圆环病毒Ⅱ型方法的建立和应用
《家畜生态学报 》 2010
摘要：根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)等3种病毒基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV VP2、PRVgB、PCV2ORF1基因的保守区为各病毒的诊断靶序列。在建立各病毒单重PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了三种病毒的多重PCR技术。用78份临床病料对本研究多重PCR技术和单重PCR技术进行对比验证,结果显示,总符合率为97.4%以上。该方法特异性强、敏感性高,为PPV、PRV和PCV2临床诊断和流行病学调查等研究提供了新手段。
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转基因玉米多重PCR-基因芯片联用的检测方法
《农业生物技术学报 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：根据7种转基因玉米(Zea mays)Bt11、Bt176、Mon810、Mon863、TC1507、GA21和NK603的重组DNA结构分别设计转化体特异性引物,并对引物特异性及灵敏度进行验证。结果表明,所设计引物特异性强,灵敏度达0.1%,在此基础上以玉米内参照基因(ZSSIIb)作对照,对Bt11、Mon810、TC1507和GA21、NK603、Bt176分别作了2对四重PCR反应。根据插入外源基因与插入位点植物基因组DNA的特异结构,分别设计和筛选了7种转基因玉米转化体特异性Oligo探针,制备转基因玉米的寡核苷酸芯片。结果表明,所设计探针特异性强,灵敏度达0.01%。利用基因芯片检测方法结合多重PCR,建立并优化了1套三重PCR反应体系和两套四重PCR反应体系,可在1张芯片上同时有效地检测及鉴定多种转基因玉米,大大提高了检测的准确率和效率。
关键词： 转基因玉米 转化体特异性检测 多重PCR Oligo探针
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