科研产出
绿原酸体外抗新型鸭呼肠孤病毒作用的研究
《农业生物技术学报 》 2020 北大核心 CSCD
摘要：由新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus, NDRV)引起的NDRV病是困扰我国养鸭业的主要疾病之一.绿原酸(chlorogenic acid, CHA)作为许多中药的主要成分,在抗病毒方面发挥着重要作用.本研究拟明确CHA在NDRV感染幼仓鼠(Mesocricetus auratus)肾细胞系BHK-21不同阶段的抗病毒作用效果,为CHA抗NDRV的临床治疗提供参考依据.首先根据NDRV的S3基因序列(GenBank No. KJ879932)设计引物,建立NDRV实时荧光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR, qPCR)检测方法;然后采用细胞增殖-毒性检测试剂盒测定CHA的细胞毒性,确定CHA在BHK-21细胞上的最大安全浓度;最后进行抗病毒试验,组Ⅰ向BHK-21细胞接种病毒NDRV,然后加入不同浓度的CHA,定期收集细胞冻融液;组Ⅱ的病毒吸附方式与组Ⅰ相同,用药前病毒NDRV先在BHK-21细胞上增殖10 h,定量检测增殖10 h后的病毒载量作为基值;以病毒增殖10 h为实验起始点,分别加入不同浓度的CHA,后续流程与组Ⅰ相同;以上两组均设置阴性和阳性对照.定期观察细胞病变,并将收集的样品进行NDRV的q PCR检测.结果显示,本研究建立的用于NDRV检测的qPCR方法最低检测限为92.5拷贝/μL;CHA在BHK-21细胞上的最大安全浓度为128μg/mL;CHA能在体外抑制NDRV增殖,存在明显的剂量效应关系.本研究可为NDRV的相关机制研究和实际应用提供基础资料.
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PK-15细胞α干扰素效应因子qPCR检测方法的建立及其初步应用
《家畜生态学报 》 2013
摘要：为建立一种用SYBR Green I荧光染料检测PK-15细胞α干扰素(α-IFN)效应因子Mx1、OAS的mRNA表达水平的qPCR检测方法,通过在猪圆环病毒2型(Porcine Circo-virus Type 2,PCV2)抑制α-IFN发挥效应的信号通路中进行初步应用。根据GenBank中目的基因的序列,利用分子生物学软件Premier 5.0在其保守区设计并合成相应的特异性引物。利用TRIzol法提取总RNA,经Oligo d(T)15进行反转录,利用PCR扩增各段目的基因,并克隆至pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH 5α,经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立SYBR Green I qPCR标准曲线和溶解曲线,并进行灵敏性、特异性和重复性试验。根据建立的实时qPCR方法,检测PCV2对α-IFN效应因子的抑制效果。对建立的PK-15细胞α-IFN效应因子SYBR Green I qPCR方法进行分析,结果表明Mx1、OAS和内参β-actin基因的Ct值与标准品稀释度在1×101～1×108 copies/μL的范围分别呈良好的线性关系。PK-15细胞在接种PCV2,并受到α-IFN刺激后Mx1、OAS的相对表达量较未接种PCV2明显降低。本试验建立了PK-15细胞α-IFN效应因子的qPCR检测方法,为在mRNA水平上对PK-15细胞α-IFN效应因子的定量分析奠定了基础,并成功地初步应用于PCV2抑制α-IFN发挥效应的信号通路研究中。
关键词： qPCR SYBRGreenI 猪圆环病毒2型 PK-15细胞 α-干扰素
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PRRS流行毒株与减毒活疫苗TJM-F92株qPCR区分方法的建立与应用
《家畜生态学报 》 2013
摘要：为快速准确区分PRRS流行毒株与减毒活疫苗TJM-F92株以及对流行毒株进行定量检测,按GenBank中发表的美洲型PRRSV SX-1分离株、弱毒疫苗株NSP2基因缺失部位的不同设计了一对特异性引物,通过RT-PCR和体外转录的方法,构建了体外转录RNA作为标准品,并对反应条件和反应体系进行优化,旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性和稳定性良好的qPCR鉴别方法。结果表明,该方法最低能检测出1.0×101拷贝/μL的模板,敏感性比常规PCR高100倍;应用该方法对218份临床样本进行鉴别与定量,qPCR检出率较常规RT-PCR高12.9个百分点。研究表明,qPCR鉴别方法的建立实现了对PRRS流行毒株与疫苗毒株的快速区分以及对流行毒株的定量检测,为PRRS的快速诊断提供了依据。
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征 qPCR 体外转录 Nsp2基因
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