科研产出
甘薯羽状斑驳病毒RT-LAMP快速检测方法的建立
《中国农业科学 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：【目的】甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)侵染甘薯造成重要危害,本研究旨在利用反转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立一种快速、高效检测SPFMV的方法。【方法】从Gen Bank上获得SPFMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列,利用Primer Explorer V4设计4条RT-LAMP特异性引物SPFMV-FIP(5′-TAAGCGCGGCTGCC TTCATC-CATTCAACCACCCCTGCA-3′)、SPFMV-BIP(5′-TCGGTTGTTTGGTTTGGACGGA-ATCAGTTGTCGTGTGCCTC-3′)、SPFMV-F3(5′-GAGTCTTGCGCGATATGCA-3′)和SPFMV-B3(5′-ACCCCTCATTCCTAAGAGGT-3′),同时设计2条反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)的特异性引物SPFMV-F(5′-TCTAATGAGAACACTGAA TT-3′)和SPFMV-R(5′-TTGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′)。分别设置F3/B3﹕FIP/BIP引物浓度比(1﹕1、1﹕2、1﹕4、1﹕6、1﹕8和1﹕10),d NTPs浓度梯度(0.025、0.125、0.225、0.325、0.425、0.525、0.625、0.725和0.825mmol·L-1),Betaine浓度梯度(0.4、0.7、1.0、1.3和1.6 mol·L-1),反应温度(59、61、63、65、67和69℃)和反应时间(20、30、40、50、60、70、80和90 min),对RT-LAMP反应体系各条件进行优化,确定最佳反应体系。通过测序及酶切对RT-LAMP产物进行鉴定。以携带SPFMV、甘薯C病毒(Sweet potato virus C,SPVC)、甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)、甘薯病毒2(Sweet potato virus 2,SPV2)、甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯G病毒(Sweet potato virus G,SPVG)、甘薯褪绿斑病毒(Sweet potato chlorotic fleck virus,SPCFV)和健康甘薯叶片的总RNA为模板,分别进行RT-LAMP和RT-PCR特异性检测;带有SPFMV的甘薯总RNA进行10倍梯度稀释,以RNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀释液为模板进行RT-LAMP和RT-PCR灵敏度测定。最后利用优化的RT-LAMP体系对山东省多地采集的SPFMV疑似病样进行检测,加入SYBR green I进行可视化检测。【结果】建立了SPFMV的RT-LAMP快速特异性检测方法,优化的反应体系:引物SPFMV-FIP/SPFMV-BIP为0.8μmol·L-1,SPFMV-F3/SPFMV-B3为0.2μmol·L-1,d NTPs为0.325mmol·L-1,Betaine为1 mol·L-1;65℃反应70 min。特异性试验显示本研究建立的RT-LAMP只对携带SPFMV的RNA能够扩增出典型的梯状条带。RT-LAMP最低可检测的RNA浓度为121.6×10-4 ng·μL-1,而RT-PCR最低能检测的RNA浓度为121.6×10-3 ng·μL-1,表明RT-LAMP的灵敏度比RT-PCR高10倍。田间样品检测,RT-LAMP扩增结果与可视化检测结果一致,表明本研究建立的RT-LAMP快速检测方法可有效应用到SPFMV的田间检测。【结论】建立的RT-LAMP快速检测方法灵敏度高、特异性好,适用于SPFMV的田间快速检测。
关键词： 甘薯 甘薯羽状斑驳病毒 反转录环介导等温扩增技术 检测
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谷物及饲料中青霉酸的污染和防控
《中国粮油学报 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：青霉酸是由不同株系的青霉菌和曲霉菌产生的次生代谢产物,具有致突变和致癌作用。圆弧青霉和软毛青霉是主要产青霉酸真菌,主要存在于谷类和饲料中。青霉酸的生物合成途径约由6步构成,1分子乙酰辅酶A同3分子丙二酸单酰辅酶A经缩合反应生成苔色酸,苔色酸经环裂解和脱羧作用而生成青霉酸。青霉酸具有细胞毒性、器官毒性、混合毒性。控制谷物和饲料原料质量、储藏及其加工运输过程,特别是控制好饲料水分和温度是控制青霉酸污染的关键。传统的检测方法包括生物学方法、免疫学方法、色谱法、质谱法等,目前单一种类真菌毒素的检测技术逐渐被多组分同时检测的方法代替。
关键词： 谷物 饲料 青霉酸 生物合成 毒性活性 检测 风险防控
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小麦植株中叶菌唑残留测定方法
《现代农药 》 2018
摘要：采用高效液相色谱建立小麦植株中叶菌唑残留测定方法。分别以乙腈、二氯甲烷为提取溶剂,通过Bond Elut Carbon固相萃取柱净化,SB-C_(18)色谱柱分离,Agilent 1260高效液相色谱仪测定。结果表明,当叶菌唑质量浓度为0.1～10.0 mg/L时,其质量浓度与色谱峰面积呈线性关系,相关系数为0.999 9。乙腈超声离心法的平均回收率为90.40%～98.39%,相对标准偏差为1.62%～5.10%;二氯甲烷萃取法的平均回收率为91.34%～95.00%,相对标准偏差为0.86%～3.89%。2种试验方法均容易操作,且灵敏度高。
关键词： 叶菌唑 残留 小麦植株 提取方法 高效液相色谱 测定
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鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的表达及ELISA诊断试剂盒的研制与应用
《浙江农业科学 》 2018
摘要：为了建立一种鸡传染性支气管炎抗体检测的ELISA方法,本研究根据GenB ank中的传染性支气管炎病毒(IBV)山东分离株LC2的N基因序列,设计一对引物,扩增N基因,将目的基因与载体pE T-32a(+)连接,构建重组表达质粒pE T-32a-N,转化E.coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白pE T-32a-N,纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原建立鸡传染性支气管炎抗体检测的间接ELISA方法,并利用所建立的ELISA方法对临床血清样本进行检测。结果表明,IBV N基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达。Western-blot检测表明,表达的重组蛋白能与鸡传染性支气管炎阳性血清发生特异性反应。确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为2μg·孔~(-1),血清最佳稀释度为1:200,临界值为D450值≥0.297,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。该方法与进口IDEXX试剂盒的符合率为96.25%,初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸡传染性支气管炎母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测。综上所述,本研究所建立的N-ELISA方法是一种有效的鸡传染性支气管炎病血清学诊断的方法,并为进一步研究IBV N蛋白的免疫原性和抗感染保护作用奠定了基础。
关键词： 鸡传染性支气管炎病毒 N基因 表达 ELISA 抗体 检测
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菁松×皓月全蚕粉的成分测定与分析
《北方蚕业 》 2018
摘要：为探明菁松×皓月蚕品种5龄第3天全蚕粉中的1-DNJ、蛋白质、脂肪、可溶性总糖、锌、铁、磷、硒、钙、铜、锰及18种游离氨基酸的成分含量,分别采用高效液相色谱(HPLC)法以及相关国家标准所规定的检测方法,对主要成分1-DNJ及其它部分营养成分的含量进行了测定。结果表明,全蚕粉与桑叶中的1-DNJ、蛋白质、脂肪、可溶性总糖、5种矿质元素、17种游离氨基酸等成分含量差异极大;主要成分1-DNJ的质量分数比桑叶高303.39%,表明家蚕食用桑叶后对桑叶中的大部分成分有很高的富集作用。
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小麦植株中叶菌唑残留测定方法
《现代农药 》 2018
摘要：采用高效液相色谱建立小麦植株中叶菌唑残留测定方法.分别以乙腈、二氯甲烷为提取溶剂,通过Bond Elut Carbon固相萃取柱净化,SB-C18色谱柱分离,Agilent 1260高效液相色谱仪测定.结果表明,当叶菌唑质量浓度为0.1~10.0 mg/L时,其质量浓度与色谱峰面积呈线性关系,相关系数为0.999 9.乙腈超声离心法的平均回收率为90.40%~98.39%,相对标准偏差为1.62%~5.10%;二氯甲烷萃取法的平均回收率为91.34%~95.00%,相对标准偏差为0.86%~3.89%.2种试验方法均容易操作,且灵敏度高.
关键词： 叶菌唑 残留 小麦植株 提取方法 高效液相色谱 测定
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保加利亚乳杆菌N-乙酰胞壁质酶的原核表达和鉴定
《山东农业科学 》 2018
摘要：为研究保加利亚乳杆菌(LB)N-乙酰胞壁质酶(Mur)的分子生物学特性,根据已发表的保加利亚乳杆菌核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,PCR扩增LB MN株不含跨膜区域序列的mur基因,片段回收后克隆至pMD19-T载体并进行鉴定,再将其亚克隆于原核表达载体pET-30a(+)中构建重组表达质粒pET-30a(+)-mur,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示重组Mur蛋白分子量约为21 kD,能在大肠杆菌中高效表达。
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降解黄曲霉毒素B_1芽孢杆菌的筛选与鉴定
《山东农业科学 》 2018
摘要：本研究以香豆素为唯一碳源进行黄曲霉毒素B_1(AFB_1)降解菌的筛选,从花生地土壤中分离出高效降解AFB_1的菌株A3042。研究该菌的上清液、菌悬液、胞内液对AFB_1降解特性。结果表明,菌株A3042能高效降解AFB_1,其胞外上清液、菌悬液和胞内液分别降解91. 7%、11. 4%和7. 6%的AFB_1,表明起降解的活性物质主要位于胞外液。综合其形态学特征、生理生化特征和16S rRNA基因分析,鉴定菌株A3042为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),命名为Bacillus cereus A3042。本研究为食品和饲料中AFB_1的生物降解提供菌种资源。
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芽孢杆菌GSBM05对葡萄白腐病菌的抑菌活性及其鉴定
《中国农学通报 》 2018 CSCD
摘要：旨在从土壤中分离筛选出对葡萄白腐病菌有强烈抑制作用的芽孢杆菌,检测其抑菌活性并进行鉴定。采用稀释平板法从土壤中分离芽孢杆菌,利用对峙培养和菌丝生长速率等方法对抑菌活性较好的芽孢杆菌GSBM05进行初步研究。结果表明,在土壤样品中共分离出40株芽孢杆菌,经初筛、复筛后得到1株具有强烈抑制效果的芽孢杆菌GSBM05。该菌株稀释20倍的无菌发酵液对孢子萌发和菌丝生长抑制率均在90%以上,发酵液不同组分对葡萄离体果实、叶片的防治效果均可达80%以上。该菌株对葡萄白腐病菌等11种植物病原菌具有良好的拮抗作用。通过形态观察、生理生化鉴定以及16S r DNA序列分析,确定该菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。实验结果表明,甲基营养型芽孢杆菌GSBM05具有良好的抑菌活性,抑菌谱较广,可为葡萄白腐病生物防治提供新资源。
关键词： 拮抗芽孢杆菌 甲基营养型芽孢杆菌 葡萄白腐病 抑菌活性 鉴定 生物防治
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