科研产出
牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)β-溶血素(hlb)的克隆、表达及溶血活性分析
《中国农业科学 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：【目的】实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性。【方法】PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应。【结果】测序结果表明,扩增片段含有993bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白;SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57kD,表达量占菌体总蛋白的23.9%;溶血效价分析,金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278HU·mg-1,对奶牛红细胞的溶血效价为9×103HU·mg-1;重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应。【结论】成功表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素,该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞,显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素,为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了理论基础。此外,重组蛋白还可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌,为兽医临床诊断提供新的方法。
关键词： 金黄色葡萄球菌 β-溶血素 克隆 表达 溶血活性 CAMP反应
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牛源无乳链球菌CAMP因子(cfb)的克隆及原核表达
《新疆农业科学 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：提取能产生CAMP反应的牛源无乳链球菌山东分离株的基因组DNA,PCR扩增CAMP因子基因,重组到pMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含有768 bp的ORF,可编码含255个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的无乳链球菌CAMP因子蛋白的氨基酸组成相比,第8位Tyr→Cys,第95位Pro→Ser,第126位Thr→Ala的3个氨基酸发生了点突变,同源性为98.4%。成功构建原核表达载体pET32a+/cfb,SDS-PAGE分析蛋白质表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为48 kD,表达量占菌体总蛋白的52.7%。这为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了条件。
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花生抗病基因分离克隆研究进展
《生物技术通讯 》 2009
摘要：花生是重要的油料作物和经济作物。近年来多种病害严重威胁着花生产业的发展,筛选花生抗病基因并对其进行研究成为花生抗性育种的新热点。结合抗病基因分离克隆在花生育种工作和遗传研究等领域逐渐显现的广阔前景,我们简要综述了国内外花生抗病基因分离克隆的研究现状,介绍了抗病基因分离克隆的类型及特点,并探讨了今后的研究方向。
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牛金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因的克隆及序列分析
《西南农业学报 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：根据GenBank上发表的金黄色葡萄球菌β-溶血素基因序列,设计了一对特异性引物。提取临床乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌山东株zfb的全基因组DNA为PCR模板,扩增β-溶血素基因,将PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸和1个终止子的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸组成同源性为99.4%。软件分析显示,克隆的金葡菌β-溶血素是一种依赖于金属离子的磷脂酶。上述结果显示,已获得金黄色葡萄球菌β-溶血素基因,为获得重组金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白及对其结构和功能的研究奠定了基础。
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微小毛霉凝乳酶基因的克隆及在毕赤酵母GS115中的表达
《山东农业科学 》 2009
摘要：以微小毛霉基因组为模板,PCR扩增得到凝乳酶结构基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,连接穿梭载体pPIC9K,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并测定其核苷酸序列。测序结果证实扩增得到的片段为凝乳酶基因,与GenBank报道的序列(No.X06219)存在6对碱基的区别。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,构建重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-m cp,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/m l、具有多拷贝基因的整合重组菌pPIC9K-m cp-03。用甲醇诱导进行初步发酵试验,测得该重组菌凝乳酶活力为5 660 U/m l,比微小毛霉发酵液提高50多倍,且发酵液电泳结果表明毕赤酵母自身分泌的蛋白很少,只能看到约38.5 ku的凝乳酶蛋白条带。
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大白菜CBF4基因的克隆和遗传进化分析
《山东农业科学 》 2009
摘要：采用RT-PCR法,从大白菜(Brassica rapasubsp.pekinensis)河头早中克隆了拟南芥CBF4的同源基因BrCBF4,并对它的序列特征、蛋白结构和遗传进化进行了分析。结果表明,BrCBF4全长663 bp,编码一个包含220个氨基酸残基和具有典型AP2结构域的蛋白,并且含有两个潜在的豆蔻酰化位点。遗传进化分析表明,BrCBF4与BjDREB1-2的关系最近,与拟南芥AtCBF4同属一个类群,而AtCBF1,2,3与大白菜的BrCBF1,2,3及其它芸薹属植物相关基因分属另一个类群。推测BrCBF4与BjDREB1-2、AtCBF4为直系同源基因,在功能上相似,而与BrCBF1,2,3存在功能上的分化。本研究为进一步研究BrCBF4在大白菜非生物逆境响应中的功能奠定了基础。
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番茄红素环化酶基因片段克隆及反义表达载体构建
《山东农业科学 》 2009
摘要：根据已知的番茄红素环化酶基因,即β环化酶基因和ε环化酶基因的保守序列设计特异性引物。提取番茄叶片的RNA,经RT-PCR反应,扩增出723 bp和569 bp的目的片段,将它们分别连接到pEASY-T1 Cloning Vector上,测序鉴定其正确性。克隆到载体上的β环化酶基因用BamHⅠ和SmaⅠ双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCb反义表达载体。同样连接到克隆载体上的ε环化酶基因用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCe反义表达载体。
关键词： 番茄红素 β环化酶基因 ε环化酶基因 克隆 反义表达载体
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桃果实乙烯反应因子PpERF1基因的克隆及序列分析
《中国农学通报 》 2009 北大核心
摘要：以成熟肥城桃果实的cDNA为模板,根据EST库中的核苷酸序列,设计2条特异引物分别与B26进行PCR扩增,结果得到了该基因下游包括3′端非编码区的765bp大小的cDNA片段。PpERF1基因全长为1263bp,包含一个708bp大小的完整开放阅读框(ORF)。序列分析表明,PpERF1与番茄、拟南芥、苹果和葡萄等在DNA结合功能域的约57个氨基酸中,同源性可达68.4%～100%,且在该区域中存在1个α-螺旋和3个反平行链构成的β-折叠结构。经同源性分析,该序列与拟南芥、葡萄、豌豆等植物的氨基酸同源性为58.8%～67.5%,属于同一类ERF家族成员。
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山东PRRSV流行株ORF5、ORF6、ORF7基因序列的分子特征
《家畜生态学报 》 2009
摘要：采用RT-PCR技术对2001~2007年分离自山东地区10株(ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和SD7)猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)进行ORF5、ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,与已知序列的毒株的相应片段进行同源性分析比较,并对其分子特征进行分析。结果表明:该10株病毒仍属北美洲型,其中2001~2002年分离的SD1株、SD2株和2006年分离的SD6株核苷酸序列之间的ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为99.2%,99.8%,100%,均与北美洲原型代表株(VR-2332株)和疫苗毒MLVRe-spPRRS Repro USA遗传距离较近,同属一大分支;2006~2007年分离的PRRSV ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD3,SD4,SD5,SD7分离株ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为97.8%~100%,99.4%~99.8%,99.2%~99.7%,均与国内96年Ch-1a和2002年HB-1株及2006年分离鉴定的国内高致病性分离株(JXA1、Shanghai、HEB1)同属一个大的分支。首次证实目前山东省同时存在高致病性PRRSV和传统PRRSV,并且有由传统PRRSV向高致病性PRRSV演化的趋势。
关键词： PRRSV 高致病性PRRSV ORF5 ORF6 ORF7 克隆 分子特征
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枯草芽孢杆菌pgsA基因的克隆及序列分析
《动物医学进展 》 2008 北大核心
摘要：根据GenBank中已发表的枯草芽孢杆菌pgsA的基因序列,设计合成了一对能扩增1 225 bp基因片段的引物。以枯草芽孢杆菌染色体DNA为模板,经PCR扩增得到目的片断,然后将其克隆到pMD18-T载体上,经蓝白斑筛选和酶切鉴定选择阳性克隆进行序列测定。经DNA Star软件将其与Gen-Bank上的pgsA序列进行同源性比较,结果表明,核苷酸同源性均在90%以上,氨基酸同源性为94%以上。核苷酸序列系统进化树分析,发现该试验株与浙江株亲缘关系最近。经ProtScale软件分析表明,该基因所编码蛋白在靠近其N端存在一个跨膜区,为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定了一定的基础。
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