科研产出
牛流行热病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用
《中国兽医科学 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：为建立牛流行热病毒(BEFV)的荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中已登录的BEFV的G基因保守序列设计了1对特异性引物.结果显示,建立的标准曲线线性关系较好,其相关系数为0.996 3.该方法仅对BEFV检测为阳性,表明其特异性强.该方法的检测下限约为4.0*10~1 copies/μL,比普通PCR敏感性高10倍.重复性试验结果显示,该方法的组内和组间变异系数均小于0.76%.利用本方法分别对45份牛病料样品进行检测,结果检出了11份阳性样品,表明所建立的荧光定量PCR方法准确可靠,可以用于BEFV的快速诊断和定量分析.
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牛病毒性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
《山东农业科学 》 2019
摘要：本研究旨在建立一种灵敏度高、特异性强、重复性好,能快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法。根据BVDV的E2基因保守序列,设计合成一对特异性引物,建立了检测BVDV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。将标准阳性样品10倍梯度稀释检测灵敏度,用能感染奶牛的其它病毒做对照检测特异性,用临床样本检测重复性。结果表明,该方法与能感染奶牛的其它几种病毒均无交叉反应,检出敏感度达4.87×10~1 copies/μL,比常规PCR检测方法高10倍。同时检测了5个规模化奶牛场送检的67份奶牛腹泻样本,其BVDV检出率为46.27%(31/67)。本研究成功建立了BVDV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为BVDV的快速诊断和定量分析提供了技术支撑,具有很好的应用前景。
关键词： 牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 荧光定量PCR E2基因 检测
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禽腺病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立
《畜牧与兽医 》 2019 北大核心
摘要：禽腺病毒4型(FAdV-4)是心包积水综合征的重要病原。本研究拟建立FAdV4荧光定量PCR检测方法,为FAdV4感染的流行病学调查、早期诊断、疫病净化提供技术手段。根据GenBank中的禽腺病毒4型六邻体(hexon)基因序列,设计一对引物,扩增hexon基因,将目的基因与载体pEASY-T3连接,构建重组阳性质粒pEAST-T3-H,利用所制备的质粒pEAST-T3-H为模板,对PCR反应体系、反应条件进行优化。建立了禽腺病毒4型SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,检出的标准品的敏感性为1.7×10拷贝/μL,优于常规的PCR检测方法。该方法与其他禽病病毒均无交叉反应。表明该方法具有特异型强、灵敏度高、重复性好的特点,可用于临床样本的检测。
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乳粉中黄曲霉毒素M_1的检测能力验证
《乳业科学与技术 》 2018
摘要：设计并实施乳粉中黄曲霉毒素M_1(aflatoxin M_1,AFM_1)的检测能力验证计划,了解和评价实验室检测乳粉中AFM_1的检测能力和水平,识别实验室间存在的差异,促进实验室提高检测水平。参照CNAS—CL002《能力验证结果的统计处理和能力评价指南》制备分割水平对的样品,采用单因素方差分析和t检验对样品均匀性和稳定性进行分析。对能力验证结果进行稳健统计分析,通过Z值比分数评价实验室能力。结果表明:样品通过均匀性和稳定性的检验要求,满足能力验证计划要求;参加实验室49家,满意结果数为45家,满意率为91.8%;多数参加实验室的检测能力评价为满意,表明乳粉中AFM_1的检测水平总体良好。实验操作误差和数据处理不当是个别实验室结果离群的主要原因。
关键词： 黄曲霉毒素M1 检测 乳粉 实验室能力验证 稳健统计
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甘薯羽状斑驳病毒RT-LAMP快速检测方法的建立
《中国农业科学 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：【目的】甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)侵染甘薯造成重要危害,本研究旨在利用反转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立一种快速、高效检测SPFMV的方法。【方法】从Gen Bank上获得SPFMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列,利用Primer Explorer V4设计4条RT-LAMP特异性引物SPFMV-FIP(5′-TAAGCGCGGCTGCC TTCATC-CATTCAACCACCCCTGCA-3′)、SPFMV-BIP(5′-TCGGTTGTTTGGTTTGGACGGA-ATCAGTTGTCGTGTGCCTC-3′)、SPFMV-F3(5′-GAGTCTTGCGCGATATGCA-3′)和SPFMV-B3(5′-ACCCCTCATTCCTAAGAGGT-3′),同时设计2条反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)的特异性引物SPFMV-F(5′-TCTAATGAGAACACTGAA TT-3′)和SPFMV-R(5′-TTGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′)。分别设置F3/B3﹕FIP/BIP引物浓度比(1﹕1、1﹕2、1﹕4、1﹕6、1﹕8和1﹕10),d NTPs浓度梯度(0.025、0.125、0.225、0.325、0.425、0.525、0.625、0.725和0.825mmol·L-1),Betaine浓度梯度(0.4、0.7、1.0、1.3和1.6 mol·L-1),反应温度(59、61、63、65、67和69℃)和反应时间(20、30、40、50、60、70、80和90 min),对RT-LAMP反应体系各条件进行优化,确定最佳反应体系。通过测序及酶切对RT-LAMP产物进行鉴定。以携带SPFMV、甘薯C病毒(Sweet potato virus C,SPVC)、甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)、甘薯病毒2(Sweet potato virus 2,SPV2)、甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯G病毒(Sweet potato virus G,SPVG)、甘薯褪绿斑病毒(Sweet potato chlorotic fleck virus,SPCFV)和健康甘薯叶片的总RNA为模板,分别进行RT-LAMP和RT-PCR特异性检测;带有SPFMV的甘薯总RNA进行10倍梯度稀释,以RNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀释液为模板进行RT-LAMP和RT-PCR灵敏度测定。最后利用优化的RT-LAMP体系对山东省多地采集的SPFMV疑似病样进行检测,加入SYBR green I进行可视化检测。【结果】建立了SPFMV的RT-LAMP快速特异性检测方法,优化的反应体系:引物SPFMV-FIP/SPFMV-BIP为0.8μmol·L-1,SPFMV-F3/SPFMV-B3为0.2μmol·L-1,d NTPs为0.325mmol·L-1,Betaine为1 mol·L-1;65℃反应70 min。特异性试验显示本研究建立的RT-LAMP只对携带SPFMV的RNA能够扩增出典型的梯状条带。RT-LAMP最低可检测的RNA浓度为121.6×10-4 ng·μL-1,而RT-PCR最低能检测的RNA浓度为121.6×10-3 ng·μL-1,表明RT-LAMP的灵敏度比RT-PCR高10倍。田间样品检测,RT-LAMP扩增结果与可视化检测结果一致,表明本研究建立的RT-LAMP快速检测方法可有效应用到SPFMV的田间检测。【结论】建立的RT-LAMP快速检测方法灵敏度高、特异性好,适用于SPFMV的田间快速检测。
关键词： 甘薯 甘薯羽状斑驳病毒 反转录环介导等温扩增技术 检测
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谷物及饲料中青霉酸的污染和防控
《中国粮油学报 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：青霉酸是由不同株系的青霉菌和曲霉菌产生的次生代谢产物,具有致突变和致癌作用。圆弧青霉和软毛青霉是主要产青霉酸真菌,主要存在于谷类和饲料中。青霉酸的生物合成途径约由6步构成,1分子乙酰辅酶A同3分子丙二酸单酰辅酶A经缩合反应生成苔色酸,苔色酸经环裂解和脱羧作用而生成青霉酸。青霉酸具有细胞毒性、器官毒性、混合毒性。控制谷物和饲料原料质量、储藏及其加工运输过程,特别是控制好饲料水分和温度是控制青霉酸污染的关键。传统的检测方法包括生物学方法、免疫学方法、色谱法、质谱法等,目前单一种类真菌毒素的检测技术逐渐被多组分同时检测的方法代替。
关键词： 谷物 饲料 青霉酸 生物合成 毒性活性 检测 风险防控
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鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的表达及ELISA诊断试剂盒的研制与应用
《浙江农业科学 》 2018
摘要：为了建立一种鸡传染性支气管炎抗体检测的ELISA方法,本研究根据GenB ank中的传染性支气管炎病毒(IBV)山东分离株LC2的N基因序列,设计一对引物,扩增N基因,将目的基因与载体pE T-32a(+)连接,构建重组表达质粒pE T-32a-N,转化E.coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白pE T-32a-N,纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原建立鸡传染性支气管炎抗体检测的间接ELISA方法,并利用所建立的ELISA方法对临床血清样本进行检测。结果表明,IBV N基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达。Western-blot检测表明,表达的重组蛋白能与鸡传染性支气管炎阳性血清发生特异性反应。确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为2μg·孔~(-1),血清最佳稀释度为1:200,临界值为D450值≥0.297,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。该方法与进口IDEXX试剂盒的符合率为96.25%,初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸡传染性支气管炎母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测。综上所述,本研究所建立的N-ELISA方法是一种有效的鸡传染性支气管炎病血清学诊断的方法,并为进一步研究IBV N蛋白的免疫原性和抗感染保护作用奠定了基础。
关键词： 鸡传染性支气管炎病毒 N基因 表达 ELISA 抗体 检测
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甘蔗花叶病毒第Ⅳ组分离物RT-PCR检测体系的建立及应用
《植物病理学报 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)是引起我国玉米矮化叶病的主要病毒。根据其基因组序列,SCMV可以分为4个组,其中第Ⅳ组分离物属于新出现的强毒株系。为了快速检测SCMV尤其是Ⅳ组分离物的发生情况,我们针对SCMV Ⅰ-Ⅳ组及Ⅳ组分离物设计了6对引物,从中筛选出特异性最强的2对引物(Ⅰ-Ⅳ-2F/Ⅰ-Ⅳ-2R和Ⅳ-1F/Ⅳ-1R),进行PCR体系的优化。优化后的PCR体系为:退火温度51℃,d NTP终浓度为0.1 mM,引物终浓度为0.20μM,Taq DNA聚合酶终浓度为0.015 U·μL~(-1)。利用该体系,引物对Ⅰ-Ⅳ-2F/Ⅰ-Ⅳ-2R和Ⅳ-1F/Ⅳ-1R均能够从50 ng感病叶片或0.05 ng病毒RNA中检测出SCMV。通过优化两对引物浓度比例建立了能同时检测SCMV所有分离物及第四组分离物的双重PCR体系。利用该体系从山东、河南及云南均检测出SCMV第Ⅳ组分离物的发生。本研究为SCMV尤其是SCMV第Ⅳ组分离物的快速检测提供了技术支持。
关键词： 甘蔗花叶病毒 第Ⅳ组 检测 反转录-聚合酶链式反应
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H9N2亚型禽流感荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
《黑龙江畜牧兽医 》 2017 北大核心
摘要：为了研究H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在家禽体内各个器官的分布,试验针对H9N2亚型AIV的HA基因设计1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin的引物,以阳性重组质粒作为标准品做标准曲线,建立荧光定量RT-PCR检测方法,并对人工感染H9N2的SPF雏鸡气管、胸腺、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠等器官进行3次重复检测。结果表明:该法线性关系R值均在0.99以上,检测极限均为10拷贝质粒DNA,比RT-PCR灵敏100倍以上;特异性好,批内和批间重复性试验变异系数均小于1%。通过比较各器官HA相对表达量,得出肠和胰腺中HA相对表达量最高,腺胃次之,脾脏、肝脏、胸腺、法氏囊中含量也比较高,气管、肺脏、肾脏中含量较低,其中肾脏含量最低。说明研究建立的H9N2亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR方法灵敏度高,特异性强。
关键词： H9N2亚型禽流感病毒 HA基因 RT-PCR 检测 病毒分布
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