科研产出
副猪嗜血杆菌ompP2基因在猪肺泡巨噬细胞中的表达
《动物医学进展 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：为了进一步研究副猪嗜血杆菌(HPS)ompP2基因的功能,根据已发表的副猪嗜血杆菌核苷酸序列,设计并合成1对引物,PCR扩增HPS LZ株外膜蛋白ompP2基因,获得大小为1 158bp的核苷酸片段,该片段纯化后克隆至pEASY-Blunt载体,转化后鉴定,再与真核表达质粒pCI-neo经过酶切和连接反应,转化感受态大肠杆菌Trans-T1,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。通过脂质体法将pCI-neoompP2转染猪肺泡巨噬细胞,通过RT-PCR和Western blot方法检测重组质粒是否表达。结果显示,成功构建了含ompP2基因的副猪嗜血杆菌真核表达载体pCI-neo-ompP2,提取转染该质粒的猪肺泡巨噬细胞的mRNA,进行RT-PCR扩增,在1 000bp~2 000bp之间可见1条明显的条带。Western blot发现在42ku处出现目的条带。试验结果为后期研究副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的机理奠定了基础。
关键词： 副猪嗜血杆菌 ompP2基因 真核表达载体 猪肺泡巨噬细胞 表达
全文链接
请求原文
花生热激蛋白AhHSP70与热激因子AhHSF基因的克隆及表达分析
《山东农业科学 》 2015
摘要：热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)和热激转录因子(heat shock factors,HSFs)在植物热胁迫信号转导和耐热性的产生过程中发挥了重要作用。本研究从花生转录组文库中筛选到HSP70、HSF的c DNA片段,通过序列比对在花生全基因组序列中获得这两个基因的基因组序列,根据序列信息设计引物,以花生叶片c DNA为模板扩增全长ORF并进行生物信息学分析。结果显示,Ah HSP70基因的ORF全长为1 962 bp,编码653个氨基酸,分子质量为71.45 k D,理论等电点p I为4.93;Ah HSF基因的ORF全长为1 212 bp,编码403个氨基酸,分子质量为46.03 k D,理论等电点p I为4.85。Ah HSP70与Ah HSF均不具有信号肽,为可溶性蛋白,二级结构中有大量无规则卷曲。利用这两个基因的氨基酸序列分别与来源于其他物种HSP70、HSF的氨基酸序列进行同源比对,并构建进化树进行亲缘关系分析,结果表明,Ah HSP70与大豆Gm HSP70亲缘关系较近,与番茄Sl HSP70亲缘关系比较远;Ah HSF与菜豆Pa HSF亲缘关系较近,而与蒺藜苜蓿Mt HSF的亲缘关系较远。利用实时荧光定量PCR对Ah HSP70和Ah HSF在热胁迫情况下的表达进行分析,结果表明这两个基因在42℃高温条件下表达量显著升高,Ah HSP70在高温胁迫3 h后表达明显升高,热处理24 h和48 h后,表达量为对照的50倍和135倍;转录因子Ah HSF在高温胁迫3 h后表达明显升高,高温处理6 h后达到最高,随后下降。本研究初步验证了花生热激蛋白和热激因子基因在花生响应高温胁迫中的作用。
关键词： 花生 热激蛋白 热激因子 基因克隆 序列分析 基因表达
全文链接
请求原文
花生中一个NBS-LRR类基因的克隆和表达分析
《山东农业科学 》 2015
摘要：本研究利用同源克隆方法,根据已知植物抗病(R)基因保守结构域设计一对简并引物,采用RTPCR方法对花生抗旱品种J11进行扩增,获得了一个通读的NBS-LRR类基因片段,命名为PDR1。PDR1长度为474 bp,核苷酸比较分析表明,PDR1与已克隆的大豆抗性基因(XM006573278)相似性为75%,与豌豆(AF123699)、苜蓿(XM003604518)抗性基因的相似性为74%;生物信息学预测其全长CDS编码框为5 838bp,编码的蛋白质含1 945个氨基酸,含有NB-ARC等保守结构域。荧光定量PCR分析表明,PDR1基因在花生幼苗根、茎、叶中均有表达,相对表达量为叶>根>茎;干旱胁迫后PDR1的相对表达量在12 h达到顶峰,随后下降,趋于平稳。本研究从花生中成功获得了NBS-LRR类基因的同源序列,为筛选新的抗旱花生种质提供了理论依据。
关键词： 花生 NBS-LRR 同源序列 基因克隆 表达分析
全文链接
请求原文
花生光敏色素AhphyA和AhphyB基因的克隆及原核表达研究
《四川农业大学学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆了花生(Arachis hypogaea L.)的2个光敏色素基因,并对其进行生物信息学分析,构建这2个基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达蛋白,为进一步纯化蛋白制备抗体以及研究这2个基因在花生发育中的作用奠定基础。【方法】首先,根据花生转录组中编码光敏色素A基因与光敏色素B基因的部分序列,以花生叶片中提取的总RNA为模板,通过RT-PCR与RACE技术对这2个基因的全长ORF序列进行克隆;然后,使用MEGA软件分析花生光敏色素与其他物种中光敏色素的亲缘关系;构建AhphyA、AhphyB的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21并诱导蛋白表达。【结果】2个基因全长ORF分别为3378bp和3 456bp,分别编码1 125和1 151个氨基酸的蛋白;其氨基酸序列与大豆的光敏色素A蛋白和光敏色素B蛋白的相似性分别为88%和90%;经SDS-PAGE检测,在大肠杆菌中2个基因均能受IPTG诱导表达产生蛋白。【结论】利用RT-PCR与RACE技术从花生中克隆得到了2个光敏色素基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。
全文链接
请求原文
鸭甲肝病毒1型和3型间接ELISA方法的建立与应用
《微生物学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：【目的】研究鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)1型VP3和3型VP1串联基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测的间接ELISA方法。【方法】设计2对特异性引物,提取鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)的RNA,分别RT-PCR扩增得到714bp的DHAV-1VP3和720bp的DHAV-3 VP1基因,并克隆至p MD18-T载体中,然后依次将DHAV-1 VP3和DHAV-3 VP1定向插入p ET-32a(+)表达载体,获得重组表达载体p ET-1VP3-3VP1,进行IPTG(Isopropyl-beta-D-1-thiogalactopyranoside)诱导表达分析,以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并应用于临床。【结果】经IPTG诱导表达,在大肠杆菌中可稳定、高效地表达DHAV-1VP3-3VP1蛋白。Western blot检测结果表明,表达的重组蛋白与DHAV-1和DHAV-3阳性血清均能发生特异性反应。确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为1.0μg/孔,血清最佳稀释度为1∶200,临界值为OD6 50值≥0.38,建立的间接ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。该方法与中和试验分别检测DHAV-3阳性血清,两种方法的符合率各为96.3%和96.7%;初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测。【结论】以大肠杆菌表达的DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白建立的间接ELISA方法可用于DHAV-1和DHAV-3抗体的检测。
关键词： 鸭甲肝病毒1型 鸭甲肝病毒3型 VP1基因 VP3基因 表达
全文链接
请求原文
棉花转录因子基因(GhMYB11)的克隆与表达分析
《农业生物技术学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：MYB基因家族在植物应对外界生物和非生物胁迫的过程中有重要的调控作用。本研究利用二倍体雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)基因组数据库,从陆地棉(G.hirsutum)品种鲁棉研32号中克隆到一个新的MYB转录因子Gh MYB11(Gen Bank登录号:HQ234875.1),c DNA全长1 001 bp,开放阅读框828bp。通过与模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和主要作物小麦(Triticum aestivum L.)、玉米(Zea mays L.)、水稻(Oryza sativa L.)MYB蛋白的氨基酸序列比对发现,Gh MYB11蛋白与拟南芥中脱落酸(abscisic acid,ABA)合成和信号传导的重要基因At MYB13/14编码的蛋白高度相似(E值分别为7e-83和1e-90),含两个高度保守的MYB结构域R2R3及一个转录激活结构域。实时定量PCR分析发现,Gh MYB11基因在黄萎病菌(Verticillium dahliae)侵染、干旱、盐和氧化胁迫处理后的棉花幼苗叶片中表达显著上调。Gh MYB11基因可能在棉花生物和非生物胁迫反应中起重要调控作用,是陆地棉品种抗逆性遗传改良的重要候选基因。本研究为利用基因工程手段提高棉花抗逆性提供了基础材料
全文链接
请求原文
核桃NBS类抗病基因的克隆及序列分析
《江苏农业科学 》 2015 北大核心
摘要：NBS-LRR蛋白在植物抵御各种病原物的侵袭中发挥重要作用。利用RT-PCR技术以香玲核桃叶片为试材,克隆核桃核苷酸结合位点(nucleotide binding site,NBS)类抗病基因类似物(resistance gene analog,RGA),并对该基因和编码蛋白序列进行分析。结果表明,该序列长512 bp,具有NBS的典型结构域。利用DNAman软件进行相似性比对发现该序列与其他植物的NBS具有较高的同源性。核桃NBS类基因的克隆为其进一步研究应用奠定了基础。
全文链接
请求原文
花生FUSCA3基因的克隆与表达分析
《核农学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：为了挖掘花生品质性状相关功能基因,本研究以花生品种花育17号为试材,根据c DNA文库中已知的FUSCA3基因全长序列设计引物,通过RT-PCR克隆到该基因,命名为Ah FUSCA3。Ah FUSCA3全长为1 532 bp,开放阅读框ORF为1 134 bp,对应的基因组序列3 892 bp,由6个外显子和5个内含子组成,内含子剪接方式符合GT-AG剪接规则。根据编码区预测Ah FUSCA3编码一条378个氨基酸组成的多肽,预测分子量为42.3 k D,等电点为5.58。预测该基因编码的蛋白含有B3保守结构域,可能定位于细胞核中。蛋白序列比对和进化树分析表明,花生与大豆(Glycine max)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)和苜蓿(Medicago truncatula)等豆科植物中的FUSCA3序列相似性最高,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,Ah FUSCA3基因表达量在花生荚果、种子发育的过程中呈现先增后降的趋势,推测Ah FUSCA3基因在花生胚胎形成和发育过程中发挥重要作用。本研究为阐明花生胚胎发育过程和油脂代谢机制提供了理论基础,为花生品质改良育种提供了新的基因资源。
核桃WRKY4基因的克隆与表达分析
《核农学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：WRKY转录调控因子广泛参与植物的生长发育、生物胁迫和非生物胁迫等生理过程。本研究利用reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)及rapid amplification of cDNA ends(RACE)技术克隆了核桃(Juglans regia L.)WRKY基因cDNA全长序列,命名为WRKY4(GenBank登录号为KC795551.1)。结果表明,克隆到的片段长度为2 174 bp,完整开放阅读框为1 554 bp,编码517个氨基酸。序列分析表明WRKY4基因含有2个WRKY保守结构域和2个C2H2锌指结构域,属于WRKY基因家族第Ⅰ类成员。利用实时荧光定量PCR分析4℃低温和自然低温条件对该基因表达的影响以及组织表达模式。结果表明WRKY4受低温诱导表达,能够在低温胁迫的早期响应这一生理过程。WRKY4在树皮(韧皮部)、雌花、花芽和叶片中均有表达,且在树皮中表达量最高,具有组织特异性。研究结果可为核桃抗寒基因工程育种提供基因资源。
关键词： 核桃 WRKY转录因子 基因克隆 实时荧光定量PCR
全文链接
请求原文
