科研产出
微小毛霉凝乳酶基因的克隆及在毕赤酵母GS115中的表达
《山东农业科学 》 2009
摘要：以微小毛霉基因组为模板,PCR扩增得到凝乳酶结构基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,连接穿梭载体pPIC9K,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并测定其核苷酸序列。测序结果证实扩增得到的片段为凝乳酶基因,与GenBank报道的序列(No.X06219)存在6对碱基的区别。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,构建重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-m cp,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/m l、具有多拷贝基因的整合重组菌pPIC9K-m cp-03。用甲醇诱导进行初步发酵试验,测得该重组菌凝乳酶活力为5 660 U/m l,比微小毛霉发酵液提高50多倍,且发酵液电泳结果表明毕赤酵母自身分泌的蛋白很少,只能看到约38.5 ku的凝乳酶蛋白条带。
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新城疫病毒SGM01分离株F基因多肽重复区的序列分析和初步表达
《山东农业科学 》 2009
摘要：从新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)SGM01强毒分离株的F基因克隆出两段七肽重复序列(Heptad Repeat Region,HR)HR1和HR2,通过氨基酸序列分析显示:SGM01分离株的HR1区与F48E9、La-Sota的同源性分别为95.2%、93.7%;HR2区与F48E9、LaSota的同源性分别为89.1%、85.5%。将HR1和HR2分别插入融合表达载体pGEX-6p-1,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,得到预期大小的目的蛋白。这为研究HR1和HR2的结构以及其在F蛋白融合过程中所起的作用奠定了基础。
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小麦胚乳14-3-3蛋白的表达及其淀粉体淀粉合成酶的互作
《作物学报 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：从小麦胚乳中克隆了14-3-3基因,并将其分别插入pET29c和pET41c质粒,用热激法转化大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RP,得到高效表达的蛋白,但融合蛋白主要以包涵体的形式存在.可溶性的融合蛋白可直接通过S-蛋白琼脂糖树脂纯化.包涵体经8 mol L-1尿素溶解变性,稀释复性后,结合到S-蛋白琼脂糖树脂上,也得到纯化的融合蛋白.复性后的融合蛋白对蔗糖合成酶活性表现抑制作用,说明包涵体14-3-3融合蛋白恢复活性.将结合14-3-3融合蛋白的S-蛋白琼脂糖树脂作为诱饵与小麦胚乳淀粉体提取液进行亲和杂交,与14-3-3蛋白特异互作的淀粉合成酶结合到S-蛋白琼脂糖树脂上,Western 检测结果表明, 淀粉体淀粉合酶I(SSI)、淀粉合酶II(SSII)、淀粉分支酶IIa(SBEIIa)、淀粉分支酶IIb(SBEIIb)和ADP焦磷酸化酶大亚基(SH2)与14-3-3蛋白存在互作,而淀粉分支酶I(SBEI)、淀粉磷酸化酶(SP)、D-酶(DE)和ADP焦磷酸化酶小亚基(BT2)不能与14-3-3蛋白结合,说明小麦胚乳14-3-3蛋白对淀粉体淀粉合成具有一定的调控作用.
关键词： 小麦14-3-3蛋白 表达 淀粉合成酶 蛋白互作
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小麦胚乳14-3-3蛋白的表达及其与淀粉体淀粉合成酶的互作
《作物学报 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：从小麦胚乳中克隆了14-3-3基因,并将其分别插入pET29c和pET41c质粒,用热激法转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP,得到高效表达的蛋白,但融合蛋白主要以包涵体的形式存在。可溶性的融合蛋白可直接通过S-蛋白琼脂糖树脂纯化。包涵体经8molL-1尿素溶解变性,稀释复性后,结合到S-蛋白琼脂糖树脂上,也得到纯化的融合蛋白。复性后的融合蛋白对蔗糖合酶活性表现抑制作用,说明包涵体14-3-3融合蛋白恢复活性。将结合14-3-3融合蛋白的S-蛋白琼脂糖树脂作为诱饵与小麦胚乳淀粉体提取液进行亲和杂交,与14-3-3蛋白特异互作的淀粉合成酶结合到S-蛋白琼脂糖树脂上,Western检测结果表明,淀粉体淀粉合酶I(SSI)、淀粉合酶II(SSII)、淀粉分支酶Iia(SBEIIa)、淀粉分支酶Iib(SBEIIb)和ADP焦磷酸化酶大亚基(SH2)与14-3-3蛋白存在互作,而淀粉分支酶I(SBEI)、淀粉磷酸化酶(SP)、D-酶(DE)和ADP焦磷酸化酶小亚基(BT2)不能与14-3-3蛋白结合,说明小麦胚乳14-3-3蛋白对淀粉体淀粉合成具有一定的调控作用。
关键词： 小麦14-3-3蛋白 表达 淀粉合成酶 蛋白互作
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奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白配基结合区基因的克隆与原核表达
《中国兽医学报 》 2008 北大核心 CSCD
摘要：运用PCR方法扩增出奶牛乳腺炎分离株10A的Fnbp配基结合区基因,该片段大小为350bp左右,将其与PGEM-T载体连接,转化到受体菌DH5α中,用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板筛选出含有重组子的菌株,鉴定成功后,测序结果表明:奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌10A的Fnbp配基结合区基因的序列与金黄色葡萄球菌Mu50、N315、MSSA476、MW2、RF122、COL以及NCTC8325的相应区域序列同源性分别为97%、97%、95%、95%、96%、94%和94%。将重组克隆载体质粒进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切回收后的DNA,定向插入到融合表达载体PET-32a中,构建了重组质粒PET-Fnbp,并转化到宿主菌BL21(DE3)株中,经IPTG4h诱导后,SDS-PAGE电泳表明,重组蛋白得到高效表达,重组蛋白主要以分泌形式存在,分子量35000左右,Ni柱纯化后的蛋白经Western-blotting检测,具有良好的抗原性和特异性。
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冬枣两个ACC氧化酶基因的cDNA克隆及其表达模式
《园艺学报 》 2008 北大核心 CSCD
摘要：根据植物ACC氧化酶(ACO)家族的氨基酸和核苷酸保守区序列设计简并引物,采用3′RACE技术从半红期冬枣果实中分离了两个ACO同源基因片段,随后通过PCR技术进一步获得了两个包含完整开放阅读框(ORF)及3′端非编码区(UTR)序列的ACO基因的cDNA,即ZjACO1和ZjACO2。两个基因序列在GenBank中的登录号为EU216549和EU216550,其大小分别为1115bp和1105bp,编码蛋白大小分别为319个和321个氨基酸。ZjACO1和ZjACO2在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为79.4%和84.0%。Northern杂交结果表明,这两个基因在冬枣叶片中不表达,在果实不同发育阶段中的表达具有明显差异。
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重组鲁西黄牛α干扰素融合蛋白的表达及其抗病毒活性研究
《生物工程学报 》 2007 北大核心 CSCD
摘要：通过PCR从鲁西黄牛(Yellowcattle)基因组DNA中克隆了α干扰素(BoIFN-α)基因,并插入到pET32a+中,构建成重组原核表达质粒pET32a+/BoIFN-α,进行测序和诱导表达。测序结果表明,鲁西黄牛IFN-α基因全长498个核苷酸,含一个开放阅读框(ORF),编码166个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的牛α干扰素C亚型氨基酸组成同源性为97.6%。表达产物经SDS-PAGE分析,表达出40kD的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26.7%。表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化,纯化产物进行复性后在MDBK/VSV上的活性为5×105u/mg。重组牛IFN-α(rBoIFN-α)对牛轮状病毒(BRV)有一定的抑制作用,抗BRV病毒活性为1.5×105u/mg。结果显示从鲁西黄牛中克隆了IFN-α基因的一种新亚型,即BoIFN-αC2,并实现了高效表达,获得了具有较高抗病毒活性的重组干扰素产物,为重组牛干扰素的开发奠定了基础。
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鲁西黄牛α干扰素基因的克隆及表达
《动物学杂志 》 2007 北大核心 CSCD
摘要：提取黄牛血液基因组DNA,PCR扩增α干扰素基因,重组到pET32a+表达载体中。测序结果表明,扩增片段含有498bp的ORF,可编码166个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的牛α干扰素C亚型氨基酸组成同源性为97.6%。构建原核表达载体pET32a+/BoIFN-α,SDS-PAGE分析蛋白质表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为40ku,表达量占菌体总蛋白的26.7%。结果从鲁西黄牛中克隆了IFN-α基因的一种新亚型,即BoIFN-αC2,构建原核表达质粒,并实现了高效表达,为重组牛干扰素的开发奠定了基础。
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