科研产出
鸡传染性支气管炎病毒S1基因在毕赤酵母中的表达及其免疫学原性分析
《浙江农业学报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：根据对山东IBV流行株的遗传变异分析,选取流行代表株LC2,扩增其S1基因,将其S1基因克隆到pPIC9K载体中,构建了真核表达质粒pPIC9K-S1,经SacⅠ线性化后,通过电转化到毕赤酵母GS115中,经MD/MM及G418筛选,PCR鉴定,获得多拷贝阳性重组菌pPIC9K-S1-GS115。将重组菌在0.5%甲醇中进行诱导分泌表达,对表达产物进行SDS-PAGE,Western blot分析。结果显示,在酵母培养基上清中检测到分子量为90 ku为目的蛋白,与鸡IBV阳性血清发生特异性反应。将表达上清及其重组菌菌体饲喂SPF鸡,40 d后采血,可检测到IBV保护性抗体。结果表明:表达的IBV的S1蛋白具有很好的免疫原性,为ELISA诊断试剂盒的研制及IBV疫苗的研制奠定基础。
关键词： 鸡传染性支气管炎病毒 S1基因 毕赤酵母 表达 免疫原性
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花生白藜芦醇合成酶基因PNRS1的克隆及其在原核中的表达
《作物学报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：采用RT-PCR克隆花生白藜芦醇合成酶(resveratrol synthetic enzyme,RS)基因全长,命名为PNRS1,GenBank登录号为FM955393。序列分析表明该基因的开放读码框1170bp,编码389个氨基酸残基。以花生品种鲁花14基因组DNA为模板经PCR扩增,获得该基因的基因组序列长1537bp,包含2个外显子和1个内含子。比较发现,PNRS1与其他已知RS序列的同源性达91%～95%。表达模式分析显示,PNRS1在花生根中特异表达,并可被紫外线UV-B诱导。PNRS1与pET-28a(+)构建原核表达载体,经IPTG诱导后可表达获得相对分子量约为46kD的外源融合蛋白。以上结果证实PNRS1属花生RS基因家族成员,并为进一步分析该基因的功能奠定了基础。
关键词： 花生 白藜芦醇合成酶 表达模式 原核表达 融合蛋白
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Asia1型口蹄疫病毒P1基因的原核表达及其抗血清的制备(英文)
《AgriculturalScience&Technology 》 2010 CSCD
摘要：[目的]研究Asial型口蹄疫病毒P1基因原核表达及其抗血清的制备。[方法]利用基因克隆技术获得Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)的P1基因,然后将P1基因重组到pET-32a(+)质粒中;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导及蛋白纯化后,进行SDS-PAGE;将重组菌BL21培养物用超声波裂解,对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备P1蛋白抗血清。[结果]获得了重组性阳性克隆;SDS-PAGE结果表明在105kD处出现了目的条带;Western-blot分析表明,抗血清可与原核表达的P1蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶5120。[结论]该研究结果为建立...
关键词： Asia1型口蹄疫病毒 P1基因 原核表达 抗血清
荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因克隆、原核表达及其抗菌活性分析
《中国农业科学 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：【目的】实现荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组BNBD12的抗菌活性。【方法】RT-PCR扩增荷斯坦牛中性粒细胞BNBD12基因,序列分析后人工合成了适于在大肠杆菌中表达的BNBD12成熟肽,构建原核表达载体pET32a(+)/BNBD12,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过琼脂扩散法分别确定重组蛋白对牛源乳腺炎主要致病菌革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌效果,应用扫描电镜观察重组蛋白的杀菌效应。【结果】测序结果表明扩增片段长度为180bp,可编码含60个氨基酸的成熟蛋白。SDS-PAGE和Western blotting分析显示人工合成的BNBD12的成熟肽基因以融合蛋白形式表达,表达量占菌体总蛋白的21.4%;纯化的重组蛋白0.05mg·mL-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显抑菌效果;扫描电镜观察发现重组蛋白作用后可引起病原菌内容物外泄而死亡。【结论】成功表达了荷斯坦牛中性粒细胞β-防御素12,该重组蛋白既可作用于革兰氏阳性菌又可作用于革兰氏阴性菌,显示出较好的临床应用前景。
关键词： β-防御素12(BNBD12) 荷斯坦牛 表达 抗菌活性 乳腺炎
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奶牛乳腺炎源性大肠杆菌csgC基因的克隆及载体构建
《中国兽医学报 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：根据GenBank上发表的curli菌毛csgC基因序列设计了1对特异性引物。从患乳腺炎的奶牛乳汁中分离出致病性大肠杆菌,经生物学鉴定后,提取全基因组DNA为模板,PCR扩增出csgC基因,连入pMD18-T克隆载体,测序,结果表明,扩增片段含有333个核苷酸,编码111个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的大肠杆菌W3110的全基因组DNA中的csgC基因序列最相近,氨基酸序列同源性为99.7%。该基因与原核表达载体pET32a+相连,转入BL21(DE3)感受态细胞。挑选阳性菌落经PCR鉴定和酶切鉴定后表明成功构建原核表达载体pET32a+/csgC。
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奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因的克隆及原核表达
《中国兽医学报 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：以提取的奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)全基因组DNA为模板,PCR扩增β-溶血素基因(hlb),并与克隆载体pMD18-T相连接。测序结果表明,扩增片段含有993bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸同源性为99.4%。构建原核表达载体pET32a+/hlb,SDS-PAGE分析蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白的相对分子量质为57000,表达量占菌体总蛋白的23.9%;表明原核表达质粒构建成功,并实现了有效表达。
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南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A在毕赤酵母中的表达、纯化及性质
《科技通报 》 2009 北大核心
摘要：将编码南极假丝酵母脂肪酶A的基因进行克隆,与pPIC9K连接构建成重组载体,并将其电转化入毕赤酵母GS115中。通过MD和MM平板及PCR扩增,筛选和鉴定重组子。重组细胞经过120 h培养后,发酵液上清酶活达到13 U/mL。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,重组脂肪酶分子量约为50 kD,比原始脂肪酶略大。粗酶液经中空纤维素膜超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀和离子柱交换层析后,得到在SDS-PAGE上显示为单一条带的重组脂肪酶。该酶最适反应温度为75℃,在70℃保持30 min后,仍具90%以上的活性,最适反应pH值为7.0,在pH6.0～8.0的范围内,具有一定的稳定性。
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