科研产出
基因工程蛋白金葡菌α-溶血素的纯化及活性检测
《西北农林科技大学学报(自然科学版) 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：【目的】分离纯化基因工程重组蛋白金黄色葡萄球菌溶血素(α-hemolysin,α-HL)并检测其生物学活性,为疫苗研发奠定基础。【方法】对含pET32a+-α-HL质粒的BL21(DE3)进行诱导表达,诱导成功后,将重组菌BL21(DE3)培养物用超声波裂解,并用凝胶过滤层析法对该基因工程蛋白进行分离纯化,用Bradford法及兔红细胞分别测定纯化产物的蛋白含量和溶血比活。【结果】纯化产物在SDS-PAGE电泳中53ku处呈现出单一清晰带,达电泳级纯度。纯化产物含量约为0.1277mg/mL,溶血比活为8192HU/mg。【结论】成功获得了金黄色葡萄球菌α-HL,且所获的α-HL具有良好的溶血活性。
关键词： α-溶血素 金黄色葡萄球菌 溶血活性 基因工程蛋白 原核表达
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花生水孔蛋白基因(AhAQ1)的克隆及盐胁迫下的表达分析(英文)
《分子植物育种 》 2009 CSCD
摘要：水孔蛋白的主要作用是控制植物体内的水分运输,在植物盐胁迫调节中也起作用。本研究采用RT-PCR的技术,从盐胁迫的花生叶片中克隆了水孔蛋白基因AhAQ1。AhAQ1编码一个由287个氨基酸残基组成的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量为30.57kD,等电点为9.04。序列分析表明AhAQ1具有6个跨膜区和2个NPA框。系统发生分析显示AhAQ1与PIP1家族聚为一类。高盐处理花生组织后,用半定量RT-PCR进行分析,结果表明,AhAQ1转录水平的表达受盐胁迫诱导,推测花生AhAQ1在应答盐胁迫反应中可能发挥作用。
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牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)β-溶血素(hlb)的克隆、表达及溶血活性分析
《中国农业科学 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：【目的】实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性。【方法】PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应。【结果】测序结果表明,扩增片段含有993bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白;SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57kD,表达量占菌体总蛋白的23.9%;溶血效价分析,金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278HU·mg-1,对奶牛红细胞的溶血效价为9×103HU·mg-1;重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应。【结论】成功表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素,该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞,显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素,为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了理论基础。此外,重组蛋白还可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌,为兽医临床诊断提供新的方法。
关键词： 金黄色葡萄球菌 β-溶血素 克隆 表达 溶血活性 CAMP反应
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牛源无乳链球菌CAMP因子(cfb)的克隆及原核表达
《新疆农业科学 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：提取能产生CAMP反应的牛源无乳链球菌山东分离株的基因组DNA,PCR扩增CAMP因子基因,重组到pMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含有768 bp的ORF,可编码含255个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的无乳链球菌CAMP因子蛋白的氨基酸组成相比,第8位Tyr→Cys,第95位Pro→Ser,第126位Thr→Ala的3个氨基酸发生了点突变,同源性为98.4%。成功构建原核表达载体pET32a+/cfb,SDS-PAGE分析蛋白质表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为48 kD,表达量占菌体总蛋白的52.7%。这为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了条件。
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牛金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因的克隆及序列分析
《西南农业学报 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：根据GenBank上发表的金黄色葡萄球菌β-溶血素基因序列,设计了一对特异性引物。提取临床乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌山东株zfb的全基因组DNA为PCR模板,扩增β-溶血素基因,将PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸和1个终止子的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸组成同源性为99.4%。软件分析显示,克隆的金葡菌β-溶血素是一种依赖于金属离子的磷脂酶。上述结果显示,已获得金黄色葡萄球菌β-溶血素基因,为获得重组金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白及对其结构和功能的研究奠定了基础。
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一个新的玉米NAC类基因(ZmNAC1)的克隆与分析
《遗传 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：NAC转录因子是近十年来新发现的具有多种生物功能的植物特异转录因子,在植物生长发育、激素调节和抵抗逆境等方面发挥着重要的作用。本研究利用电子克隆方法,结合RT-PCR分析,从玉米中克隆了一个与NAC类基因同源的cDNA序列,命名为ZmNAC1(GenBank登录号:EU224278),该序列长度为1029bp,具有单一的完整开放阅读框架(ORF,26～907bp),推测编码蛋白含有293个氨基酸,分子量为32.3kDa,等电点为8.65。半定量RT-PCR分析表明,ZmNAC1可以被低温、聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)、高盐和ABA诱导。这些结果表明,ZmNAC1可能参与植物逆境反应。本研究是有关玉米NAC转录因子基因的首次报道。
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微小毛霉凝乳酶基因的克隆及在毕赤酵母GS115中的表达
《山东农业科学 》 2009
摘要：以微小毛霉基因组为模板,PCR扩增得到凝乳酶结构基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,连接穿梭载体pPIC9K,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并测定其核苷酸序列。测序结果证实扩增得到的片段为凝乳酶基因,与GenBank报道的序列(No.X06219)存在6对碱基的区别。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,构建重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-m cp,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/m l、具有多拷贝基因的整合重组菌pPIC9K-m cp-03。用甲醇诱导进行初步发酵试验,测得该重组菌凝乳酶活力为5 660 U/m l,比微小毛霉发酵液提高50多倍,且发酵液电泳结果表明毕赤酵母自身分泌的蛋白很少,只能看到约38.5 ku的凝乳酶蛋白条带。
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新城疫病毒SGM01分离株F基因多肽重复区的序列分析和初步表达
《山东农业科学 》 2009
摘要：从新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)SGM01强毒分离株的F基因克隆出两段七肽重复序列(Heptad Repeat Region,HR)HR1和HR2,通过氨基酸序列分析显示:SGM01分离株的HR1区与F48E9、La-Sota的同源性分别为95.2%、93.7%;HR2区与F48E9、LaSota的同源性分别为89.1%、85.5%。将HR1和HR2分别插入融合表达载体pGEX-6p-1,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,得到预期大小的目的蛋白。这为研究HR1和HR2的结构以及其在F蛋白融合过程中所起的作用奠定了基础。
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小麦胚乳14-3-3蛋白的表达及其淀粉体淀粉合成酶的互作
《作物学报 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：从小麦胚乳中克隆了14-3-3基因,并将其分别插入pET29c和pET41c质粒,用热激法转化大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RP,得到高效表达的蛋白,但融合蛋白主要以包涵体的形式存在.可溶性的融合蛋白可直接通过S-蛋白琼脂糖树脂纯化.包涵体经8 mol L-1尿素溶解变性,稀释复性后,结合到S-蛋白琼脂糖树脂上,也得到纯化的融合蛋白.复性后的融合蛋白对蔗糖合成酶活性表现抑制作用,说明包涵体14-3-3融合蛋白恢复活性.将结合14-3-3融合蛋白的S-蛋白琼脂糖树脂作为诱饵与小麦胚乳淀粉体提取液进行亲和杂交,与14-3-3蛋白特异互作的淀粉合成酶结合到S-蛋白琼脂糖树脂上,Western 检测结果表明, 淀粉体淀粉合酶I(SSI)、淀粉合酶II(SSII)、淀粉分支酶IIa(SBEIIa)、淀粉分支酶IIb(SBEIIb)和ADP焦磷酸化酶大亚基(SH2)与14-3-3蛋白存在互作,而淀粉分支酶I(SBEI)、淀粉磷酸化酶(SP)、D-酶(DE)和ADP焦磷酸化酶小亚基(BT2)不能与14-3-3蛋白结合,说明小麦胚乳14-3-3蛋白对淀粉体淀粉合成具有一定的调控作用.
关键词： 小麦14-3-3蛋白 表达 淀粉合成酶 蛋白互作
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