科研产出
高表达牛气管防御素的真核重组载体的构建及其鉴定
《西南农业学报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：根据GeneBank中牛TAP的序列设计了1对特异性引物,采用RT-PCR方法从牛气管组织扩增牛TAP基因,并克隆到pEASY-T3载体。测序结果表明,扩增的片段含有144 bp核苷酸,编码48个氨基酸,与已报道的bTAP有1个氨基酸不同。该基因与真核表达载体FG9重组,经过PCR,酶切和测序鉴定,筛选牛TAP基因重组真核表达载体。使用脂质体法将FG9-TAP重组质粒转染293T细胞,斑点ELISA检测结果表明,成功构建了高表达牛TAP基因的真核表达载体,为抗金黄色葡萄球菌转牛TAP基因奶牛培育研究奠定基础。
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鸡传染性支气管炎病毒S1基因在毕赤酵母中的表达及其免疫学原性分析
《浙江农业学报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：根据对山东IBV流行株的遗传变异分析,选取流行代表株LC2,扩增其S1基因,将其S1基因克隆到pPIC9K载体中,构建了真核表达质粒pPIC9K-S1,经SacⅠ线性化后,通过电转化到毕赤酵母GS115中,经MD/MM及G418筛选,PCR鉴定,获得多拷贝阳性重组菌pPIC9K-S1-GS115。将重组菌在0.5%甲醇中进行诱导分泌表达,对表达产物进行SDS-PAGE,Western blot分析。结果显示,在酵母培养基上清中检测到分子量为90 ku为目的蛋白,与鸡IBV阳性血清发生特异性反应。将表达上清及其重组菌菌体饲喂SPF鸡,40 d后采血,可检测到IBV保护性抗体。结果表明:表达的IBV的S1蛋白具有很好的免疫原性,为ELISA诊断试剂盒的研制及IBV疫苗的研制奠定基础。
关键词： 鸡传染性支气管炎病毒 S1基因 毕赤酵母 表达 免疫原性
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花生白藜芦醇合成酶基因PNRS1的克隆及其在原核中的表达
《作物学报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：采用RT-PCR克隆花生白藜芦醇合成酶(resveratrol synthetic enzyme,RS)基因全长,命名为PNRS1,GenBank登录号为FM955393。序列分析表明该基因的开放读码框1170bp,编码389个氨基酸残基。以花生品种鲁花14基因组DNA为模板经PCR扩增,获得该基因的基因组序列长1537bp,包含2个外显子和1个内含子。比较发现,PNRS1与其他已知RS序列的同源性达91%～95%。表达模式分析显示,PNRS1在花生根中特异表达,并可被紫外线UV-B诱导。PNRS1与pET-28a(+)构建原核表达载体,经IPTG诱导后可表达获得相对分子量约为46kD的外源融合蛋白。以上结果证实PNRS1属花生RS基因家族成员,并为进一步分析该基因的功能奠定了基础。
关键词： 花生 白藜芦醇合成酶 表达模式 原核表达 融合蛋白
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荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因克隆、原核表达及其抗菌活性分析
《中国农业科学 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：【目的】实现荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组BNBD12的抗菌活性。【方法】RT-PCR扩增荷斯坦牛中性粒细胞BNBD12基因,序列分析后人工合成了适于在大肠杆菌中表达的BNBD12成熟肽,构建原核表达载体pET32a(+)/BNBD12,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过琼脂扩散法分别确定重组蛋白对牛源乳腺炎主要致病菌革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌效果,应用扫描电镜观察重组蛋白的杀菌效应。【结果】测序结果表明扩增片段长度为180bp,可编码含60个氨基酸的成熟蛋白。SDS-PAGE和Western blotting分析显示人工合成的BNBD12的成熟肽基因以融合蛋白形式表达,表达量占菌体总蛋白的21.4%;纯化的重组蛋白0.05mg·mL-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显抑菌效果;扫描电镜观察发现重组蛋白作用后可引起病原菌内容物外泄而死亡。【结论】成功表达了荷斯坦牛中性粒细胞β-防御素12,该重组蛋白既可作用于革兰氏阳性菌又可作用于革兰氏阴性菌,显示出较好的临床应用前景。
关键词： β-防御素12(BNBD12) 荷斯坦牛 表达 抗菌活性 乳腺炎
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奶牛乳腺炎源性大肠杆菌csgC基因的克隆及载体构建
《中国兽医学报 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：根据GenBank上发表的curli菌毛csgC基因序列设计了1对特异性引物。从患乳腺炎的奶牛乳汁中分离出致病性大肠杆菌,经生物学鉴定后,提取全基因组DNA为模板,PCR扩增出csgC基因,连入pMD18-T克隆载体,测序,结果表明,扩增片段含有333个核苷酸,编码111个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的大肠杆菌W3110的全基因组DNA中的csgC基因序列最相近,氨基酸序列同源性为99.7%。该基因与原核表达载体pET32a+相连,转入BL21(DE3)感受态细胞。挑选阳性菌落经PCR鉴定和酶切鉴定后表明成功构建原核表达载体pET32a+/csgC。
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奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因的克隆及原核表达
《中国兽医学报 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：以提取的奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)全基因组DNA为模板,PCR扩增β-溶血素基因(hlb),并与克隆载体pMD18-T相连接。测序结果表明,扩增片段含有993bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸同源性为99.4%。构建原核表达载体pET32a+/hlb,SDS-PAGE分析蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白的相对分子量质为57000,表达量占菌体总蛋白的23.9%;表明原核表达质粒构建成功,并实现了有效表达。
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基因工程蛋白金葡菌α-溶血素的纯化及活性检测
《西北农林科技大学学报(自然科学版) 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：【目的】分离纯化基因工程重组蛋白金黄色葡萄球菌溶血素(α-hemolysin,α-HL)并检测其生物学活性,为疫苗研发奠定基础。【方法】对含pET32a+-α-HL质粒的BL21(DE3)进行诱导表达,诱导成功后,将重组菌BL21(DE3)培养物用超声波裂解,并用凝胶过滤层析法对该基因工程蛋白进行分离纯化,用Bradford法及兔红细胞分别测定纯化产物的蛋白含量和溶血比活。【结果】纯化产物在SDS-PAGE电泳中53ku处呈现出单一清晰带,达电泳级纯度。纯化产物含量约为0.1277mg/mL,溶血比活为8192HU/mg。【结论】成功获得了金黄色葡萄球菌α-HL,且所获的α-HL具有良好的溶血活性。
关键词： α-溶血素 金黄色葡萄球菌 溶血活性 基因工程蛋白 原核表达
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花生水孔蛋白基因(AhAQ1)的克隆及盐胁迫下的表达分析(英文)
《分子植物育种 》 2009 CSCD
摘要：水孔蛋白的主要作用是控制植物体内的水分运输,在植物盐胁迫调节中也起作用。本研究采用RT-PCR的技术,从盐胁迫的花生叶片中克隆了水孔蛋白基因AhAQ1。AhAQ1编码一个由287个氨基酸残基组成的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量为30.57kD,等电点为9.04。序列分析表明AhAQ1具有6个跨膜区和2个NPA框。系统发生分析显示AhAQ1与PIP1家族聚为一类。高盐处理花生组织后,用半定量RT-PCR进行分析,结果表明,AhAQ1转录水平的表达受盐胁迫诱导,推测花生AhAQ1在应答盐胁迫反应中可能发挥作用。
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牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)β-溶血素(hlb)的克隆、表达及溶血活性分析
《中国农业科学 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：【目的】实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性。【方法】PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应。【结果】测序结果表明,扩增片段含有993bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白;SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57kD,表达量占菌体总蛋白的23.9%;溶血效价分析,金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278HU·mg-1,对奶牛红细胞的溶血效价为9×103HU·mg-1;重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应。【结论】成功表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素,该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞,显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素,为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了理论基础。此外,重组蛋白还可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌,为兽医临床诊断提供新的方法。
关键词： 金黄色葡萄球菌 β-溶血素 克隆 表达 溶血活性 CAMP反应
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