科研产出
牛整合素β6基因的原核表达及其抗血清的制备研究
《安徽农业科学 》 2011 北大核心
摘要：[目的]为深入研究ITGB6亚基的基因功能奠定基础。[方法]利用基因克隆技术获得整合素β6基因(ITGB6)胞外区,然后将其重组到pET-32a(+)质粒中,经鉴定及序列分析确定获得了重组阳性克隆;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导及蛋白纯化。[结果]SDS-PAGE结果显示,在94 kD处出现特异性条带;对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备ITGB6蛋白抗血清,Western-blot分析表明抗血清可与原核表达的ITGB6蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶2 560。[结论]成功表达了牛的重组整合素β6基因。
全文链接
请求原文
花生二氢黄酮醇还原酶基因(DFR)的克隆及表达分析
《农业生物技术学报 》 2011 北大核心 CSCD
摘要：二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是植物花青素合成过程中的关键酶,催化二氢黄酮醇生成无色花青素。本研究利用花生(Arachis hypogae a L.)未成熟种子cDNA文库,通过大规模EST测序,从花生中克隆了DFR基因的全长cDNA序列。序列分析表明,花生DFR蛋白氨基酸序列与其他植物来源的DFR有很高的同源性。利用花生cDNA芯片和半定量RT-PCR方法对花生DFR基因表达模式的研究发现,DFR基因在果针中表达水平最高,其次是花,在根和叶中有微量表达;不同种皮颜色花生品种的种子中表达差异明显,随种皮颜色的加深,DFR基因表达增强,在中花9号黑色种子中表达量最高。对茎叶紫色花生种质材料的研究表明,在紫色组织中DFR基因表达较强。结果表明DFR表达量与花青素积累量呈正相关,说明DFR催化反应是花青素合成途径的关键步骤。
全文链接
请求原文
花生油体蛋白家族基因的克隆和表达分析
《农业生物技术学报 》 2011 北大核心 CSCD
摘要：油体蛋白是一类覆盖在油体表面的碱性小分子蛋白。油体蛋白的存在对于维护油体的稳定性非常重要,油体蛋白也是种子作为生物反应器表达重组外源蛋白的重要载体。本研究通过构建花生(Arachishypogaea L.)未成熟种子的全长cDNA文库,测序得到284条编码油体蛋白的EST。根据编码蛋白分子量的大小可将花生油体蛋白基因分为6个亚族:AhOLEO-16.9、AhOLEO-17.7、AhOLEO-18.6、AhOLEO-22、AhOLEO-18.4和AhOLEO-14.3(GenBank登录号分别为:EG372527、EG373122、EG373716、EG372719、EE125019和EE124234),其中AhOLEO-16.9,AhOLEO-17.7和AhOLEO-14.3分别有2个成员,其它家族的各只有1个成员。本研究首次从花生中克隆了分子较大的AhOLEO-22。cDNA芯片和半定量PCR结果表明6个亚族的油体蛋白基因在花生的不同器官和在种子不同发育时期表达模式相似,在根、茎、叶、花中几乎检测不到油体蛋白基因的表达,在种子中表达量高,在果针入土15 d内几乎检测不到油体蛋白基因的表达,随着种子发育成熟油体蛋白基因的表达量逐步提高。本研究为研究花生油体蛋白基因的家族构成和利用花生油体蛋白基因提高花生含油量、生产外源蛋白等提供了有用的信息。
全文链接
请求原文
中国明对虾酚氧化酶原基因cDNA的克隆与表达特征
《水产学报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：利用3′和5′RACE技术从中国明对虾血细胞中克隆了一个酚氧化酶原基因FCproPO,FCproPO基因cDNA全长为2311bp,其中开放阅读框2061bp,编码687个氨基酸,预测分子量为78.71ku。推测的序列与凡纳滨对虾同源性为84%,与日本囊对虾同源性为71%。RT-PCR实验结果表明,FCproPO在血细胞中的相对表达量最高,在心脏和精巢中几乎不表达。序列分析发现FCproPO含有两个保守的铜离子结合位点;进化分析发现FCproPO与斑节对虾、日本囊对虾、凡纳滨对虾等海水虾的酚氧化酶原亲缘关系最近。该基因在被鳗弧菌和对虾白斑病毒(WSSV)感染后的对虾肝胰腺中的表达量显著增加,并具有不同的时空表达趋势,提示中国明对虾FCproPO基因在免疫反应中具有重要作用。
全文链接
请求原文
具有绿色荧光标记的表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞系的建立(英文)
《Agricultural Science & Technology 》 2010
摘要：[目的]建立具有绿色荧光标记的表达T7RNA聚合酶的稳定细胞系。[方法]从BL21(DE3)大肠杆菌中克隆出T7RNAP基因,定向克隆进质粒FG12后,构建了表达T7RNA聚合酶基因(T7)的Lenti-virus重组质粒FG12-T7RNAP。用此重组质粒转染293T细胞,WB可检测出瞬时表达的T7RNAP蛋白;利用辅助质粒对表达T7的非复制型Lenti-virus病毒进行体外包装,所获得的非复制型Lenti-virus病毒感染BHK-21细胞,利用GFP通过流式细胞分选仪筛选表达T7的细胞系,并利用WB检测基因的表达。[结果]通过WB检测出不同代次的阳性细胞中均能稳定表达目的基因T7RNA聚合酶。[结论]T7RNA聚合酶能顺利在真核细胞内表达,并在此基础上建立的稳定细胞系为RNA病毒体内拯救技术平台的建立奠定了基础。
全文链接
请求原文
牛轮状病毒VP4基因与LTB基因的融合表达及免疫原性研究
《西南农业学报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：PCR扩增轮状病毒VP4基因和大肠杆菌LTB基因编码区,将其克隆至pET32a载体上,构建pET32a-VP4-LTB质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),PCR、酶切鉴定后进一步测序,测序结果表明融合基因片段由2637 bp组成,为编码879个氨基酸残基的多肽。经IPTG诱导和SDS-PAGE检测发现表达产物分子量约为118.9 KD,以包涵体的形式存在。融合蛋白经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化后免疫小鼠,结果所产生的抗体效价高于单独VP4蛋白的免疫结果但差异不显著(P>0.5),但与对照组相比差异显著。表明所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性,为研制牛轮状病毒亚单位疫苗奠定了基础。
全文链接
请求原文
Asia1型口蹄疫病毒P1基因的原核表达及其抗血清的制备(英文)
《Agricultural Science & Technology 》 2010
摘要：[目的]研究Asial型口蹄疫病毒P1基因原核表达及其抗血清的制备。[方法]利用基因克隆技术获得Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)的P1基因,然后将P1基因重组到pET-32a(+)质粒中;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导及蛋白纯化后,进行SDS-PAGE;将重组菌BL21培养物用超声波裂解,对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备P1蛋白抗血清。[结果]获得了重组性阳性克隆;SDS-PAGE结果表明在105kD处出现了目的条带;Western-blot分析表明,抗血清可与原核表达的P1蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶5120。[结论]该研究结果为建立FMDV的血清学诊断方法及其基因工程疫苗的研究奠定了基础。
关键词： Asia1型口蹄疫病毒 P1基因 原核表达 抗血清
全文链接
请求原文
牛气管抗菌肽的原核表达、体外抗菌活性及其组织分布分析
《畜牧兽医学报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：本文旨在对牛气管抗菌肽(tracheal antimicrobial peptide,TAP)基因进行原核表达,以及研究重组蛋白的抗菌活性,并分析TAP在各组织的表达分布情况,为开展转TAP基因抗乳腺炎奶牛研究提供技术资料。作者采用RT-PCR从荷斯坦奶牛气管扩增TAP基因,分析其序列后根据大肠杆菌表达系统对密码子的偏好性,人工合成牛TAP基因,构建pET32a(+)-TAP重组质粒;然后转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并纯化。对表达蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot鉴定;在线软件分析目的蛋白表达量。采用滤纸片法测定重组牛TAP的体外抗菌活性,并用RT-PCR法分析牛各组织中TAP表达情况。测序结果表明,扩增到114bp目的基因片段,可编码含38个氨基酸残基的成熟蛋白。SDS-PAGE分析表达的融合蛋白相对分子质量为24ku,重组蛋白以可溶性方式存在,表达量占菌体总蛋白的52.1%。Western Blot检测只出现单一条带。抗菌效价分析表明0.115μg·μL-1重组蛋白对牛源金黄色葡萄球菌有一定的抗菌活性。TAP基因在奶牛咽喉、肺、气管、小肠、肝、心脏及口腔黏膜中均有表达,在鼻黏膜和舌黏膜中微量表达,在皮肤中几乎不表达。作者成功表达了牛TAP基因,重组牛TAP蛋白在大肠杆菌中实现高效表达,并具有一定的抗奶牛乳腺炎致病菌的活性,为未来培育抗乳腺炎转基因奶牛及相关基因工程产品的开发奠定了基础。
全文链接
请求原文
薹菜CYP79B_5基因的克隆及原核表达
《南京农业大学学报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：以薹菜品种京研薹菜叶片cDNA为模板,采用RT-PCR技术,获得了编码薹菜CYP79B5基因全序列1 847 bp,包含有1 620 bp的开放阅读框,编码540个氨基酸。以薹菜基因组DNA为模板,获得了2 112 bp的目的片段。经比对发现其氨基酸序列与油菜、白芥、拟南芥等CYP79B5编码的氨基酸序列具有较高同源性,与油菜同源性达100%。经过生物信息学分析,发现所推导的氨基酸序列具有明显的CYP蛋白信号域,且可以在SWISS-MODEL数据库中搜索到与之相近的三维结构。扩增CYP79B5完整的编码区序列,构建pET-24α(+)重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导融合蛋白高效表达,SDS-PAGE电泳检测发现在相对分子质量64 000处有一特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致。
全文链接
请求原文
