科研产出
PCV2、PRV、PPV多重PCR检测方法的建立及其应用
《家畜生态学报 》 2019 北大核心
摘要：根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)有关基因序列,通过序列比对及参考相关文献,设计了3对特异性引物。通过优化,建立了可同时检测PCV2、PRV及PPV 3种病毒的多重PCR方法。结果表明,该方法能同时检测到PCV2、PRV及PPV的最低核酸量分别为40pg、72pg、46pg。对猪圆环病毒3型(PCV3)、猪细环病毒(TTSuV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)无扩增。应用该方法对87份临床样品进行检测,PCV2阳性检出率为28.7%(25/87),PRV野毒检出率为11.5%(10/87),PPV检出率为12.6%(11/87)。其中2种以上病毒混合感染阳性率为13.8%(12/87),3种病毒同时感染的阳性率为2.3%(2/87),其结果也与单一PCR结果一致。研究结果提示,该方法可用于PCV2、PRV、PPV三种病原的单一感染或混合感染的鉴别诊断。
关键词： 猪圆环病毒2型 猪伪狂犬病毒 猪细小病毒 多重PCR
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猪圆环病毒2型Cap蛋白原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化
《黑龙江畜牧兽医 》 2019 北大核心
摘要：为了表达并纯化猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)Cap蛋白,试验将ORF2基因的密码子改造为大肠杆菌嗜好的密码子,但编码的氨基酸序列不变。合成优化后将ORF2基因全部基因序列,克隆于pET-30a原核表达载体并转化至大肠杆菌BL21中,经PCR和测序鉴定阳性克隆后,采用IPTG诱导表达目的蛋白。优化蛋白表达条件,采用Ni-NTA亲和层析胶纯化目的蛋白。结果表明:基因序列合成正确,无点突变。重组质粒成功转化入大肠杆菌BL21中,经诱导表达出现约37 ku的蛋白条带,与预期分子量大小一致。优化表达条件后,加入终浓度为1.2 mmol/L IPTG诱导6 h,表达产物含量最高。经Western-blot检测,能被PCV-2抗体阳性血清结合。说明成功构建了PCV-2 Cap蛋白的原核表达质粒pET-30a-ORF2,优化了表达条件并纯化出目的蛋白。
关键词： 猪圆环病毒2型 Cap蛋白 ORF2 原核表达 优化条件 纯化
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猪圆环病毒2型Rep蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
《家畜生态学报 》 2018 北大核心
摘要：本研究旨在制备猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白单克隆抗体。PQE30-PCV2Rep蛋白在IPTG的诱导下表达,用SDS-PAGE对表达产物进行检测。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,ELASA法鉴定抗体亚型及效价。结果显示重组蛋白PQE30-PCV2Rep得到高效表达,筛选获得了3株稳定分泌抗Rep蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系1G4、2G4和6H12,其分泌的抗体分别为IgG2a、IgG2b、IgG2b亚型。其中,6H12抗体效价为256K,浓度为0.47mg/mL,纯度>90%。本研究制备的单克隆抗体有较好的生物学特性,为PCV2的研究及快速诊断提供了新的方法。
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PK-15细胞α干扰素效应因子qPCR检测方法的建立及其初步应用
《家畜生态学报 》 2013
摘要：为建立一种用SYBR Green I荧光染料检测PK-15细胞α干扰素(α-IFN)效应因子Mx1、OAS的mRNA表达水平的qPCR检测方法,通过在猪圆环病毒2型(Porcine Circo-virus Type 2,PCV2)抑制α-IFN发挥效应的信号通路中进行初步应用。根据GenBank中目的基因的序列,利用分子生物学软件Premier 5.0在其保守区设计并合成相应的特异性引物。利用TRIzol法提取总RNA,经Oligo d(T)15进行反转录,利用PCR扩增各段目的基因,并克隆至pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH 5α,经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立SYBR Green I qPCR标准曲线和溶解曲线,并进行灵敏性、特异性和重复性试验。根据建立的实时qPCR方法,检测PCV2对α-IFN效应因子的抑制效果。对建立的PK-15细胞α-IFN效应因子SYBR Green I qPCR方法进行分析,结果表明Mx1、OAS和内参β-actin基因的Ct值与标准品稀释度在1×101～1×108 copies/μL的范围分别呈良好的线性关系。PK-15细胞在接种PCV2,并受到α-IFN刺激后Mx1、OAS的相对表达量较未接种PCV2明显降低。本试验建立了PK-15细胞α-IFN效应因子的qPCR检测方法,为在mRNA水平上对PK-15细胞α-IFN效应因子的定量分析奠定了基础,并成功地初步应用于PCV2抑制α-IFN发挥效应的信号通路研究中。
关键词： qPCR SYBRGreenI 猪圆环病毒2型 PK-15细胞 α-干扰素
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PCV2a和PCV2b感染性克隆的体外拯救
《家畜生态学报 》 2012
摘要：研究旨在获得PCV2a和PCV2b的拯救毒株。对筛选得到的PCV2a和PCV2b感染性克隆分别进行酶切,使酶切得到的全长基因组DNA自身环化并分别转染PK15细胞。经IFA和PCR验证,确认成功拯救出两亚型PCV2病毒。病毒传至第9代时对PCV2a和PCV2b的毒价分别进行测定,结果显示PCV2a的毒价为103.5 TCID50/mL,PCV2b的毒价为104.6 TCID50/mL。本试验为分型特异性序列与病毒致病力相关性的研究打下了基础。
关键词： 猪圆环病毒2型 分型特异性序列 自身环化 体外拯救
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猪圆环病毒2型特异性荧光定量PCR检测方法的建立与应用
《家畜生态学报 》 2011
摘要：研究旨在建立基于SYBR Green I荧光定量PCR检测PCV 2的技术方法。根据GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV 2)的基因序列(HQ148879),设计一对特异性引物,利用普通PCR技术扩增出PCV 2的ORF2基因702bp片段,并克隆到pVAX1载体,以纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为阳性标准品,摸索荧光定量PCR试验,并绘制标准曲线,以此建立一种荧光定量PCR特异性检测猪圆环病毒的方法。结果表明,该方法对PCV 2有很好的特异性,其敏感性比常规PCR高100倍,批间与批内重复试验变异系数均小于2.5%。经临床应用表明荧光定量PCR方法的建立实现了对PCV 2特异性的快速诊断和定量检测。
关键词： 猪圆环病毒2型 SYBR Green I 荧光定量PCR 特异性
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6株猪圆环病毒2型山东分离株ORF2基因的克隆与序列分析
《畜牧与兽医 》 2010 北大核心
摘要：分别从山东省6个地区的猪圆环病毒2型(PCV2)阳性病料中PCR扩增ORF2基因。以ORF2为靶基因进行6个毒株的分子流行病学分析。序列同源性分析表明,6个毒株之间的核苷酸序列同源性为93.3%～99.7%,氨基酸序列同源性为92.3%～100%;氨基酸序列存在2个高变区,分别位于序列的57～90和190～220位区域,其中57～90区域位于结构蛋白的免疫反应活性区;遗传进化树分析显示,SDI、SD Ⅲ、SD Ⅴ、SD Ⅵ与法国株和中国农大株共同形成一群,可能起源于共同的祖先;SD0282、SD Ⅳ与其他7株PCV2毒株共同形成另一大群,与海南株的亲缘关系最近;结合GenBank报道的山东境内分离的13个毒株的ORF2基因序列进行RFLP分析,可将该省PCV2流行毒株分为CHN-2H型、CHN-2F型、CHN-2I型和二种新的基因型,命名为CHN-2J和CHN-2K型。其中,CH-2H型所占比例最高,为优势基因型,是引起该省规模化猪场暴发PCV2疾病的主要基因型,因此研制防治该省PCV2的疫苗应以此基因型为主。
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猪圆环病毒2型双拷贝感染性DNA的构建及体外拯救
《生物工程学报 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：感染性分子克隆是研究病毒复制和致病机制的有力工具。本研究应用PCR诱变技术解决了外源片段易于自连的难题,成功将2个PCV2SD1株全基因组(DQ346683)头尾相接插入到真核生物表达载体pSK的多克隆位点中,构建重组质粒pSK-2PCV2;另外课题组成功构建含单个PCV2全基因组的pSK-PCV2和自身环化质粒ds-PCV2。将所得3种质粒分别转染无PCV污染的PK-15细胞系,经10次连续传代后,间接免疫荧光试验检测显示三者均在细胞核中聚集大量的病毒抗原;经RT-PCR检测都有PCV2特异性基因转录;透射电镜下可观察到直径约为17～20nm的典型PCV2病毒粒子;经测序鉴定所拯救出的病毒与亲本病毒核苷酸同源性为100%。拯救出的PCV2与亲本病毒具有相同的病毒学及分子生物学特性。本研究应用PCR诱变技术成功构建PCV2双拷贝感染性克隆,并经体外拯救证实其具有感染性,为进行PCV2分子特性及致病机理研究打下了基础。
关键词： 猪圆环病毒2型 单拷贝 双拷贝 自身环化 感染性克隆 体外拯救
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