科研产出
明小花蝽卵黄原蛋白的鉴定及表达分析
《山东农业科学 》 2024
摘要：本研究对明小花蝽Orius nagaii的卵黄原蛋白(vitellogenin, Vg)进行结构分析、原核表达、抗体制备以及时空动态表达分析，旨在为昆虫卵黄原蛋白的研究提供理论依据。用RACE方法克隆出OnVg基因全长，运用生物信息网站分析OnVg蛋白得出其具有3个保守结构域：脂蛋白N端结构域、未知功能结构域以及血管性血友病因子结构域。构建OnVg的原核表达载体pET-32a-c(+)-OnVg,转至大肠杆菌进行诱导表达，通过免疫昆明小鼠制备了anti-OnVg抗体。Western blot结果显示anti-OnVg抗体与OnVg蛋白能够特异性结合。qPCR检测Vg基因在明小花蝽若虫、成虫阶段和成虫不同组织中的时空动态表达，结果表明Vg基因在若虫阶段最低，成虫阶段表达量升高且3 d时表达水平达到最高；成虫腹部表达量最高，其次是肠道和卵巢。本研究结果可为探究明小花蝽的生殖调控机理提供理论支持。
关键词： 明小花蝽 卵黄原蛋白 原核表达 抗体制备 时空表达
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非洲猪瘟病毒p22蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
《山东农业科学 》 2023
摘要：非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种高度传染性病毒性疾病,发病率和死亡率高达 100%,对我国的生猪养殖业造成了毁灭性打击.p22 蛋白为ASFV的结构蛋白,本研究构建了重组原核表达质粒pET-32a-p22,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞表达重组p22 蛋白并纯化,经Western blot鉴定证实重组p22 蛋白与ASFV阳性血清有良好的免疫反应性.利用重组p22 蛋白免疫Balb/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到 2 株能够稳定分泌p22 蛋白单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株 2D6 和 5E7.经抗体亚型鉴定两株抗体均为IgG1 型;经Western blot鉴定,两株抗体能够特异性识别过表达的p22 蛋白.综上,本研究成功表达并纯化了p22 重组蛋白,制备了p22 单克隆抗体,为进一步探讨p22 蛋白的结构功能及其在ASFV中的感染致病机制提供了基础条件.
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兔轮状病毒VP8*蛋白原核表达、基因序列及蛋白特性分析
《畜牧与兽医 》 2023 北大核心
摘要：为深入研究兔轮状病毒VP8*蛋白的结构和功能，本研究利用生物信息学软件DNAStar对兔轮状病毒Z3171株的VP8*基因序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析，运用生物信息学方法对该蛋白的理化性质、亲/疏水性、磷酸化及糖基化位点、结构域、中和表位及三维结构等进行了分析。设计合成引物，采用PCR方法扩增VP8*蛋白编码基因，并将目的片段克隆到pET28a（+）原核表达载体，经体外原核表达，采用亲和层析纯化获得VP8*目的蛋白。结果显示：Z3171株的VP8*基因与国内外参考序列对比，核苷酸序列同源性为32.8%～90.3%,氨基酸序列同源性为39.2%～91.9%。生物信息学分析显示该蛋白理化性质稳定，无跨膜结构域，不含有信号肽，主要定位于细胞骨架中。其中1个中和表位区域内有2个氨基酸插入，该区域三维构象亦发生变化。PCR扩增的VP8*基因条带大小为558 bp,经测序与目的基因完全一致；经SDS-PAGE和Western blot鉴定，重组VP8*蛋白以可溶形式表达，血凝性试验结果表明该蛋白无血凝性。本研究为VP8*免疫原性分析及研制兔轮状病毒疫苗提供了参考。
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非洲猪瘟病毒A104R蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定
《中国兽医杂志 》 2022 北大核心
摘要：为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)重组蛋白A104R(rA104R)及研制抗rA104R的多克隆抗体,本研究通过ExPASy等在线生物信息学软件初步预测该蛋白的理化性质、信号肽、核定位信号等信息,继而合成ASFV的A104R基因,构建基于pET-28a(+)载体的原核表达系统.重组蛋白用Ni亲和层析纯化后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blotting和液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术鉴定.纯化的蛋白免疫6-8周龄BALB/c小鼠,制备抗rA104R的多克隆抗体,通过West-ern blotting 和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定其反应性和免疫原性.结果显示,原核表达载体构建成功;重组菌在37℃诱导8 h后表达量最高,在包涵体和上清中均有表达,表明其呈部分可溶性表达;纯化的重组蛋白大小约16 kDa,且反应性良好;LC-MS分析结果显示,该rA104R蛋白多个肽段均与目标蛋白的氨基酸序列相匹配,匹配率为59%;制备的鼠源抗rA104R多克隆抗体效价大于1∶2 048 000,具有良好的免疫原性.结果表明,本研究制备的rA104R及其多克隆抗体可进一步用于生物学功能研究,并可为疫苗及相关诊断试剂研制提供基础材料.
关键词： 非洲猪瘟病毒 原核表达 A104R重组蛋白 液相色谱-质谱
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口蹄疫病毒3B蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备
《畜牧与兽医 》 2021 北大核心
摘要：为了深入研究口蹄疫病毒3B蛋白的结构及功能,本研究原核表达了3B蛋白并制备了针对3B蛋白的多克隆抗体。试验采用PCR方法扩增了口蹄疫病毒3B蛋白基因,并将其克隆到pET28a载体上,构建了重组质粒pET28a-3B,将其转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达。经过Ni-NTA琼脂糖亲和层析法初步纯化及Millipore超滤浓缩进一步纯化,将其免疫试验动物新西兰大白兔后制备出了抗3B蛋白的多克隆抗体。通过ELISA检测了该多抗的效价,Western blot试验检测了其反应性,通过间接免疫荧光（IFA）和Western blot试验检测了该多抗的应用性。结果表明:该抗体的效价为1∶512 000,反应性良好;IFA试验和Western blot试验中可以检测到过表达后定位于细胞核和细胞质中的3B蛋白,也可以检测到在真核细胞中过表达的3B蛋白。说明本研究制备的口蹄疫病毒3B蛋白多克隆抗体可以作为开展该病毒相关研究的重要材料。
关键词： 口蹄疫病毒 3B蛋白 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体
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非洲猪瘟病毒UBCv1的原核表达及多抗制备
《北京农学院学报 》 2021
摘要：【目的】为研究非洲猪瘟病毒（ASFV）泛素结合酶（UBCv1）的生物学功能及致病机制奠定基础。【方法】以p3XFLAG-CMV-7.1-I215L质粒为模板,利用PCR方法扩增非洲猪瘟病毒I215L基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a,构建pET-28a-I215L重组质粒,并将其转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。重组蛋白经His柱层析纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性。【结果】成功构建了重组质粒pET-28a-I215L,重组菌经IPTG诱导后能够可溶性表达重组蛋白,产物约28 kDa,与预测大小一致。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶7 290 000;Western blot结果显示抗体具有较好的特异性。【结论】成功表达纯化了ASFV的泛素结合酶并制备其多克隆抗体,为后期解析ASFV泛素结合酶的结构、功能及病毒相关致病机制提供了重要的生物材料。
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集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 slr1501的克隆及原核表达分析
《山东农业科学 》 2019
摘要：组蛋白乙酰基转移酶上调表达与抗逆性有一定相关性。集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 Slr1501是一个未知蛋白,预测其属于组蛋白乙酰基转移酶GNAT家族N-乙酰基转移酶。为了进一步明确slr1501基因功能,本研究从集胞藻6803中克隆slr1501基因,成功构建了pET-28a(+)-slr1501原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行分析。经1 mmol/L IPTG诱导2 h后Slr1501蛋白成功表达,表达量随诱导时间的延长而增加,且主要以包涵体形式表达。Western blot检测结果显示Slr1501重组蛋白特异性表达。本试验结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。
关键词： 集胞藻6803 乙酰基转移酶 slr1501 原核表达 基因功能
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猪圆环病毒2型Cap蛋白原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化
《黑龙江畜牧兽医 》 2019 北大核心
摘要：为了表达并纯化猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)Cap蛋白,试验将ORF2基因的密码子改造为大肠杆菌嗜好的密码子,但编码的氨基酸序列不变。合成优化后将ORF2基因全部基因序列,克隆于pET-30a原核表达载体并转化至大肠杆菌BL21中,经PCR和测序鉴定阳性克隆后,采用IPTG诱导表达目的蛋白。优化蛋白表达条件,采用Ni-NTA亲和层析胶纯化目的蛋白。结果表明:基因序列合成正确,无点突变。重组质粒成功转化入大肠杆菌BL21中,经诱导表达出现约37 ku的蛋白条带,与预期分子量大小一致。优化表达条件后,加入终浓度为1.2 mmol/L IPTG诱导6 h,表达产物含量最高。经Western-blot检测,能被PCV-2抗体阳性血清结合。说明成功构建了PCV-2 Cap蛋白的原核表达质粒pET-30a-ORF2,优化了表达条件并纯化出目的蛋白。
关键词： 猪圆环病毒2型 Cap蛋白 ORF2 原核表达 优化条件 纯化
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口蹄疫病毒3C蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
《畜牧与兽医 》 2019 北大核心
摘要：扩增口蹄疫病毒(FMDV) 3C蛋白编码基因,将其克隆到原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达; 3C重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA和Western blot检测多克隆抗体的效价和特异性,并将该抗体通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot应用于3C的检测。ELISA结果显示,制备的3C蛋白多克隆抗体效价达1∶256 000; IFA结果显示,该抗体能够检测到3C蛋白在细胞中的定位; Western blot结果显示,该多克隆抗体能够检测到在细胞中过表达的3C蛋白。本研究制备的FMDV 3C蛋白多克隆抗体为FMDV及其3C蛋白的相关研究提供了重要的物质基础。
关键词： FMDV 3C蛋白 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体
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