科研产出
马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因的原核表达及抗血清的制备
《园艺学报 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：利用RT-PCR扩增马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白(CP)基因(PLRV-CP),回收大小约630bp的特异性扩增片段并进行T-A克隆,测序表明该基因长度为627bp,与已报道的36个PLRV-CP基因的核苷酸序列的同源性大于96%。以pBAD/Thio-TOPO为起始载体,构建了PLRV-CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP。以pBAD-LRCP为模板,用PCR法删除了该基因富含精氨酸稀有密码子的第52～177核苷酸,获得了PLRV缺失突变CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP-126。用阿拉伯糖诱导工程菌TOP10(pBAD-LRCP-126),获得了34kD的诱导表达的融合蛋白(重组CP)。用镍离子亲和层析法从包涵体中纯化出了高纯度的重组CP,用纯化的重组CP作抗原免疫家兔获得了PLRV特异性的抗血清,间接ELISA检测显示效价为1︰12800。本研究结果为利用重组CP作抗原大量制备PLRV抗血清奠定了基础。
关键词： 马铃薯卷叶病毒 CP基因 缺失突变 原核表达 抗血清
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曲霉来源植酸酶基因phyA的克隆及原核表达
《山东农业科学 》 2012
摘要：在饲料中添加植酸酶可以提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收,并减轻动物排泄物中磷对环境的污染,具有广泛的应用前景。本试验以自行分离得到的黑曲霉菌株基因组DNA为模板,克隆得到植酸酶phyA基因,并将其连接到原核表达载体pET21b、pET30a上,利用热激转化的方法将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建植酸酶大肠杆菌工程菌株。工程菌株在经诱导后可以产生大量的植酸酶蛋白。
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中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2 cDNA的克隆与原核表达
《中国畜牧兽医 》 2012 北大核心
摘要：本试验旨在克隆并表达中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2,MD-2)基因,并用West-ern blotting进行鉴定。采用RT-PCR技术从中国荷斯坦奶牛外周血白细胞中扩增MD-2cDNA,并将扩增产物与pMD20-T载体连接,重组质粒经测序鉴定后,构建pET28a-MD-2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明,目的基因含有1个483bp的开放阅读框,编码161个氨基酸;与黄牛、黑猩猩和小鼠MD-2的cDNA序列同源性分别为99.38%、77.02%、68.12%,氨基酸同源性分别为98.75%、65.00%和58.13%。融合蛋白以包涵体的形式存在,分子质量约为25ku。说明本研究成功克隆并表达了中国荷斯坦奶牛MD-2cDNA,为其进一步的功能研究提供了理论依据。
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ScMYB原核蛋白诱导表达的影响因素研究(英文)
《Agricultural Science & Technology 》 2012
摘要：[目的]探讨ScMYB原核蛋白诱导表达的影响因素,优化表达条件。[方法]构建了ScMYB::pEASY-E1原核表达载体,研究了诱导剂IPTG浓度、诱导时间、温度及菌体浓度对该蛋白表达的影响。[结果]诱导剂IPTG浓度对表达量影响不大,而与诱导时间、温度及菌体浓度均有关。[结论]在37℃,诱导4h及OD600达0.6-1.0时,ScMYB原核蛋白诱导表达量最大。
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人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)(1354-1802)的原核表达及抗血清制备
《安徽农业科学 》 2012 北大核心
摘要：[目的]制备人组织型纤溶酶原激活剂t-PA(1354-1802)抗血清,并测定其效价,为深入研究t-PA基因功能奠定基础。[方法]利用基因克隆技术获得t-PA(1354-1802)催化域基因片段,然后将其重组到pET-32a(+)质粒中,进行鉴定及序列分析;将测序正确的阳性质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导、蛋白纯化及免疫兔试验。[结果]SDS-PAGE结果显示,37 kD处出现特异性条带;对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备t-PA蛋白抗血清,Western blot分析表明,抗血清可与标准品t-PA蛋白特异性结合,间接ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶12 800。[结论]成功制备了t-PA(1354-1802)抗血清,为t-PA基因功能的深入研究奠定了基础。
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李矮缩病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达研究
《中国农学通报 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：为制备李矮缩病毒(prunus dwarf virus,PDV)抗血清,克隆PDV外壳蛋白(CP)基因,构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。以阳性感病甜樱桃叶片为试验材料,提取总RNA,根据PDV CP基因(L28145.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-PDVCP,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达。PDV CP基因(GenBank登录号:JF333587.1)全长657 bp,编码217个氨基酸,与GenBank其他PDV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89.2%~93.9%,推导的氨基酸序列同源性为97%~99%。根据完整CP基因核苷酸序列构建系统进化树显示:12个PDV分离物可分为3组,泰安分离物与巴西、土耳其等分离物属于Ⅰ组。成功构建原核表达载体pET30a-PDVCP,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。转pET30a-PDVCP载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白。该重组蛋白在30℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导4 h表达量最大。
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ScMYB原核蛋白诱导表达的影响因素研究
《安徽农业科学 》 2012 北大核心
摘要：[目的]探讨ScMYB原核蛋白诱导表达的影响因素,优化表达条件。[方法]利用构建的ScMYB::pEASY-E1为表达载体,研究了诱导剂IPTG浓度、诱导时间、诱导温度及菌体浓度对该蛋白表达的影响。[结果]诱导剂IPTG浓度对表达量影响不大,其表达主要与诱导时间、温度及菌体浓度有关。[结论]在37℃诱导4 h,当OD600达0.6～1.0时,ScMYB原核蛋白诱导表达量最大。
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鸭坦布苏病毒包膜蛋白的原核表达和间接ELISA抗体检测方法的建立
《动物医学进展 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：为建立特异性和敏感性高的检测鸭坦布苏病毒感染的方法,采用原核表达系统对鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因进行了克隆与表达,SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白大小为54.3ku。Western blot结果表明,经亲和层析法纯化后的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组E蛋白作为包被抗原,初步建立了检测E蛋白抗体的间接ELISA方法。对ELISA各种反应条件进行了优化,确定了最适工作条件。优化后确定的抗原最适包被浓度为7μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶320,酶标抗体最适稀释度为1∶1 000。在优化条件下,阴性和阳性临界值判定标准为0.324 4。本研究建立的快速检测DT-MUV抗体的间接ELISA方法为该病的检测和流行病学调查提供了技术手段。
关键词： 鸭坦布苏病毒 包膜蛋白 原核表达 间接酶联免疫吸附试验
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Asia1型口蹄疫病毒P1基因的原核表达及其抗血清的制备
《安徽农业科学 》 2011 北大核心
摘要：[目的]研究Asial型口蹄疫病毒P1基因原核表达及其抗血清的制备。[方法]利用基因克隆技术获得Asia1型口蹄疫病毒(FM-DV)的P1基因,然后将P1基因重组到pET-32a(+)质粒中;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导及蛋白纯化后,进行SDS-PAGE分析;将重组菌BL21培养物用超声波裂解,对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备P1蛋白抗血清。[结果]获得了重组性阳性克隆;SDS-PAGE结果表明在105 kD处出现了目的条带;Western-blot分析表明,抗血清可与原核表达的P1蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶5 120,[结论]为建立FMDV的血清学诊断方法及其基因工程疫苗的研究奠定了基础。
关键词： Asia1型口蹄疫病毒 P1基因 原核表达 抗血清
牛整合素β6基因的原核表达及其抗血清的制备研究
《安徽农业科学 》 2011 北大核心
摘要：[目的]为深入研究ITGB6亚基的基因功能奠定基础。[方法]利用基因克隆技术获得整合素β6基因(ITGB6)胞外区,然后将其重组到pET-32a(+)质粒中,经鉴定及序列分析确定获得了重组阳性克隆;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导及蛋白纯化。[结果]SDS-PAGE结果显示,在94 kD处出现特异性条带;对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备ITGB6蛋白抗血清,Western-blot分析表明抗血清可与原核表达的ITGB6蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶2 560。[结论]成功表达了牛的重组整合素β6基因。
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