科研产出
平榛脱水素基因的克隆与表达分析
《园艺学报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：以平榛(Corylus heterophylla Fisch.)花芽为试材,采用 RT-PCR 和 RACE 方法克隆了一个平榛与脱水素基因同源的 cDNA 基因,命名为 ChDHN(GenBank 登录号 HM228389),其全长 639 bp,具有一个 504 bp 的潜在编码区,编码 167 个氨基酸组成的多肽,具有 LEA 类家族成员具有的特征多肽序列,属于 Y4SK2类型 DHN 基因,预测 ChDHN 蛋白质分子量 18.03 kD,预测其理论等电点为 7.28。对ChDHN 的时空表达特性进行了研究,以 Actin 为内参,对 ChDHN 在 4 ℃冷激条件下(0、2、4、8、24和 48 h)的表达模式进行了初步的研究,冷激处理后 ChDHN 表现逐渐上调的表达趋势,24 h 达到最大表达量,48 h 表达量降低;推测 ChDHN 属于植物冷适应调节网络中的应答基因;定量 RT-PCR 分析 ChDHN在不同器官中的表达,在种子中高丰度表达,其次是雄花序和花芽,在树皮中表达最低。用 PCR、酶切和测序鉴定等方法检测已成功构建重组表达载体 pET-32a(+)-DHN,将鉴定完全正确的重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3),经 SDS-PAGE 分析并经过 Western blotting 鉴定,表明重组蛋白被 IPTG 诱导后高效表达出一条比预测分子量 18.03 kD 大 4 kD 的融合蛋白。
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小麦胚乳14-3-3基因的克隆及其重组蛋白的原核表达
《中国农业科学 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆小麦籽粒胚乳14-3-3基因,并进行体外表达,为进一步研究其对籽粒生长发育的调控作用奠定基础。【方法】根据已有同源基因保守序列,设计插入限制性酶切位点的特异性扩增引物,采用RT-PCR方法扩增发育的小麦胚乳14-3-3基因,克隆测序后转入表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并进行纯化。【结果】从开花后灌浆13—15 d的小麦品种济麦22籽粒胚乳中克隆到1个14-3-3基因,序列分析表明为非ε型,含1个777 bp的开放阅读框,编码蛋白259 aa,分子量约29 kD。核苷酸序列分析表明与小麦、水稻、玉米、大麦、大豆等主要农作物和模式植物拟南芥的14-3-3基因有较高的同源性,最高达98%,编码蛋白氨基酸长度也一致(260aa左右);在大肠杆菌中高效表达的重组蛋白约为30 kD,分子量大小与根据核苷酸序列推导的编码蛋白一致。从基因序列的同源性、编码蛋白的氨基酸长度、表达蛋白的分子量大小分析都说明克隆到的基因为14-3-3基因,并准确插入表达载体,得到了高效正确表达。将克隆的基因插入pET29c载体,热激转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP,得到了高效表达,但主要以包涵体形式(80%)存在。对重组蛋白进行了纯化,可溶性重组蛋白利用S-蛋白琼脂糖树脂得到纯化的蛋白,包涵体重组蛋白经变性溶解、复性后,也利用S-蛋白琼脂糖树脂得到了高度纯化的重组蛋白。【结论】利用RT-PCR技术从发育的小麦胚乳中克隆到1个14-3-3基因,并在大肠杆菌中得到了高效表达,重组蛋白经过纯化得到了纯度较高的活性蛋白。
关键词： 小麦 14-3-3蛋白 基因克隆 重组蛋白 原核表达
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ScMYB原核蛋白诱导表达的影响因素研究(英文)
《Agricultural Science & Technology 》 2012
摘要：[目的]探讨ScMYB原核蛋白诱导表达的影响因素,优化表达条件。[方法]构建了ScMYB::pEASY-E1原核表达载体,研究了诱导剂IPTG浓度、诱导时间、温度及菌体浓度对该蛋白表达的影响。[结果]诱导剂IPTG浓度对表达量影响不大,而与诱导时间、温度及菌体浓度均有关。[结论]在37℃,诱导4h及OD600达0.6-1.0时,ScMYB原核蛋白诱导表达量最大。
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人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)(1354-1802)的原核表达及抗血清制备
《安徽农业科学 》 2012 北大核心
摘要：[目的]制备人组织型纤溶酶原激活剂t-PA(1354-1802)抗血清,并测定其效价,为深入研究t-PA基因功能奠定基础。[方法]利用基因克隆技术获得t-PA(1354-1802)催化域基因片段,然后将其重组到pET-32a(+)质粒中,进行鉴定及序列分析;将测序正确的阳性质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导、蛋白纯化及免疫兔试验。[结果]SDS-PAGE结果显示,37 kD处出现特异性条带;对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备t-PA蛋白抗血清,Western blot分析表明,抗血清可与标准品t-PA蛋白特异性结合,间接ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶12 800。[结论]成功制备了t-PA(1354-1802)抗血清,为t-PA基因功能的深入研究奠定了基础。
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牛轮状病毒结构蛋白VP4基因的真核表达
《安徽农业科学 》 2012 北大核心
摘要：[目的]克隆获得牛轮状病毒VP4全基因,并进行真核表达。[方法]采用RT-PCR技术,从牛轮状病毒总RNA中扩增出VP4基因,将其重组到含有Flag标签的pcDNA3.1(+)载体中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,通过Lipofect2000TM转染293T细胞,细胞增殖后经RT-PCR和Western Blot检测VP4基因的表达。[结果]获得了VP4基因的阳性重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-VP4;转染293T细胞后经RT-PCR和Western Blot检测表明,该基因的重组表达载体构建正确,可在293T细胞内瞬时表达。[结论]VP4基因的重组真核表达载体构建成功并可在真核表达细胞内表达,该研究为VP4基因的DNA疫苗的研发及应用奠定了基础。
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鸭坦布苏病毒E基因的克隆表达及初步应用
《浙江农业学报 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：利用PCR方法从鸭坦布苏病毒山东分离株(BZ株)扩增整个E基因,全长1 503 bp,克隆到pMD18-T载体中,然后将双酶切目的片段亚克隆入pET-28a(+)载体,构建出重组表达质粒PET28a-E。将PET28a-E转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导可表达出分子量约54.8 kD的蛋白,Western blotting试验呈阳性,表明E蛋白有很好的反应原性。以纯化的表达产物作为包被抗原,鸭坦布苏病毒血清为一抗,HRP标记的羊抗鸭IgG为二抗建立间接ELISA方法。采用该方法对80份送检鸭血清进行检测,并与中和试验进行比较,结果显示,两者的符合率为95.0%,表明该方法具有较好的应用前景。
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ScMYB原核蛋白诱导表达的影响因素研究
《安徽农业科学 》 2012 北大核心
摘要：[目的]探讨ScMYB原核蛋白诱导表达的影响因素,优化表达条件。[方法]利用构建的ScMYB::pEASY-E1为表达载体,研究了诱导剂IPTG浓度、诱导时间、诱导温度及菌体浓度对该蛋白表达的影响。[结果]诱导剂IPTG浓度对表达量影响不大,其表达主要与诱导时间、温度及菌体浓度有关。[结论]在37℃诱导4 h,当OD600达0.6～1.0时,ScMYB原核蛋白诱导表达量最大。
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鸭坦布苏病毒包膜蛋白的原核表达和间接ELISA抗体检测方法的建立
《动物医学进展 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：为建立特异性和敏感性高的检测鸭坦布苏病毒感染的方法,采用原核表达系统对鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因进行了克隆与表达,SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白大小为54.3ku。Western blot结果表明,经亲和层析法纯化后的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组E蛋白作为包被抗原,初步建立了检测E蛋白抗体的间接ELISA方法。对ELISA各种反应条件进行了优化,确定了最适工作条件。优化后确定的抗原最适包被浓度为7μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶320,酶标抗体最适稀释度为1∶1 000。在优化条件下,阴性和阳性临界值判定标准为0.324 4。本研究建立的快速检测DT-MUV抗体的间接ELISA方法为该病的检测和流行病学调查提供了技术手段。
关键词： 鸭坦布苏病毒 包膜蛋白 原核表达 间接酶联免疫吸附试验
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黄瓜扩张蛋白Cs-EXP10基因5'序列的克隆和表达的初步分析
《华北农学报 》 2011 北大核心 CSCD
摘要：扩张蛋白是促进植物细胞壁伸展的一类蛋白质,黄瓜果实膨大过程中扩张蛋白具有重要作用。本研究以发育中的黄瓜果实RNA为试验材料,通过RACE方法克隆了黄瓜Cs-EXP10基因的5'端未知序列,进而获得了该基因的全长,序列分析显示该基因编码287个氨基酸,有扩张蛋白的特征序列。Southern杂交表明Cs-EXP10在基因组中是以单拷贝形式存在的。其表达具有组织特异性,在膨大过程中的果实中表达量高,显示其与果实的膨大有关。在叶和茎组织中也有少量表达,而在根和花中基本不表达。
关键词： 黄瓜 Cs-EXP10基因 克隆 表达
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Asia1型口蹄疫病毒P1基因的原核表达及其抗血清的制备
《安徽农业科学 》 2011 北大核心
摘要：[目的]研究Asial型口蹄疫病毒P1基因原核表达及其抗血清的制备。[方法]利用基因克隆技术获得Asia1型口蹄疫病毒(FM-DV)的P1基因,然后将P1基因重组到pET-32a(+)质粒中;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导及蛋白纯化后,进行SDS-PAGE分析;将重组菌BL21培养物用超声波裂解,对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备P1蛋白抗血清。[结果]获得了重组性阳性克隆;SDS-PAGE结果表明在105 kD处出现了目的条带;Western-blot分析表明,抗血清可与原核表达的P1蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶5 120,[结论]为建立FMDV的血清学诊断方法及其基因工程疫苗的研究奠定了基础。
关键词： Asia1型口蹄疫病毒 P1基因 原核表达 抗血清
