科研产出
苹果NADP依赖的苹果酸酶基因克隆、序列和表达分析
《中国农业科学 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：[目的]克隆苹果(Malus*domestica B.)中苹果酸代谢的关键酶基因MdNADP-ME,进行序列特征分析,研究MdNADP-ME在苹果中组织表达的情况.[方法]利用RT-PCR技术获得苹果MdNADP-ME1,2,3全长的cDNA序列.对该序列进行生物信息学分析,采用荧光实时定量PCR技术研究MdNADP-ME1,2,3的组织表达.[结果]测序结果显示,获得的3个NADP-苹果酸酶基因(MdNADP-ME1、MdNADP-ME2和MdNADP-ME3;GenBank登录号为JX971883、JX971884和JX971885),其ORF分别为1 512、1 782和1 926 bp,推测其分别编码503、593和641个氨基酸的多肽.氨基酸序列和结构分析显示,这3个基因均含有5个保守的氨基酸区域(motif I-V),含有2个功能结构域:malic和NADbind1malicenz.进化树分析结果显示,MdNADP-ME1和MdNADP-ME2属于双子叶植物细胞质NADP-ME型,MdNADP-ME3属于双子叶植物质体NADP-ME型.荧光实时定量PCR结果表明,MdNADP-ME1-3在被检测的组织中均有表达,但表达差异明显.[结论]MdNADP-ME1-3属于植物NADP-ME家族,结构高度保守,并且在苹果的不同组织中有不同表达模式.
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山东省不同时期主推小麦品种的籽粒淀粉合成比较
《植物生理学报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：籽粒淀粉含量对小麦产量和加工品质有重要影响,本实验对1949年以来山东省不同时期8个主要小麦推广品种籽粒灌浆过程中淀粉含量、淀粉合成关键酶活性和酶基因表达的动态变化进行了比较,以期为小麦遗传改良提供理论依据。结果表明,8个小麦品种籽粒总淀粉含量和直、支链淀粉含量随着育成时间的推移表现明显的上升趋势,与籽粒产量的变化一致。籽粒灌浆过程中,淀粉合成关键酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉粒束缚淀粉合酶(GBSS)和淀粉分支酶(SBE)活性及其编码基因相对表达量呈单峰模式,在花后20 d达到顶峰;可溶性淀粉合酶(SSS)花后10 d以后呈缓慢下降的趋势。AGPase和SSS活性及其编码基因相对表达量随着品种育成年代的推移呈上升的趋势,近年选育的‘济南17’和‘济麦22’显著高于其他品种,而GBSS和SBE酶活性及其编码基因表达量变化趋势不明显。相关分析结果表明,AGPase和SSS酶活性及其编码基因表达水平与成熟期籽粒淀粉含量的相关性高于GBSS和SBE酶,说明胚乳淀粉合成在提高小麦籽粒产量方面具有重要作用,AGPase和SSS对淀粉含量的影响可能超过GBSS和SBE。
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虹鳟Ⅰ型干扰素基因的表达与纯化
《动物医学进展 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：为了获得能用于抗虹鳟(Rainbow trout,学名,Oncorhynchus mykiss)病毒性疾病生物制剂开发的高纯度Ⅰ型干扰素(rtIFN3)蛋白,克隆了虹鳟rtIFN3,构建了pET21a-rtIFN3/BL21(DE3)原核表达与发酵系,并对rtIFN3进行了表达。重组的rtIFN3分子质量约18.5ku,以包涵体形式表达,表达量占全菌蛋白量的16%。随后,提取2L发酵瓶的包涵体蛋白,经变性与复性后,再经分子筛和阴离子交换层析进行纯化。纯化后,rtIFN3SDS-PAGE电泳结果表明蛋白纯度达98%,复性率为3%。本研究获得的高纯度复性蛋白为生物制剂的研制提供了材料。
关键词： 虹鳟干扰素(rtIFN) 表达 发酵 纯化
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CmMLO2:一个与甜瓜白粉病感病相关的新基因
《园艺学报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：通过RT-PCR方法从甜瓜中克隆得到白粉病感病相关基因CmMLO2的cDNA序列,GenBank登录号为FJ713542。该基因ORF全长1713bp,可编码由570个氨基酸组成的蛋白质,具有7个跨膜螺旋结构,属于典型的跨膜蛋白。RT-PCR结果表明,CmMLO2主要在甜瓜叶片中表达,具有组织特异性。在受到白粉病菌胁迫时CmMLO2表达显著上调,表明CmMLO2很有可能与白粉病发病有关。构建RNAi表达载体pFGC1008-CmMLO2后,利用叶盘转化法转化甜瓜,获得了PCR阳性植株,白粉病接种鉴定结果表明,转化植株对白粉病具有抗性,证明通过ihpRNAi敲除CmMLO2,可以获得对白粉病具有抗性的甜瓜材料。
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苹果NAD–苹果酸酶基因的克隆及在不同组织和果实发育阶段的表达分析
《园艺学报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：NAD-malic enzyme(NAD-ME)是植物调控苹果酸代谢中的关键酶。以富士苹果(Malus×domestica Borkh.)叶片为试材,通过同源比对和RT-PCR技术,克隆获得2个NAD–苹果酸酶基因(MdNAD-ME1和MdNAD-ME2)。其ORF分别为1 785 bp和1 818 bp,推测其分别编码595和605个氨基酸的多肽。氨基酸序列和结构分析显示,含有5个保守的氨基酸区域(Ⅰ~Ⅴ),包含2个功能结构域:malic和NAD_bind_1_malic_enz。进化树分析结果显示,MdNAD-ME1属于α组双子叶亚组,MdNAD-ME2属于β组双子叶亚组。荧光实时定量结果显示,MdNAD-ME在被检测的组织中呈组成型表达,且在多种组织中MdNAD-ME1表达量高于MdNAD-ME2。在富士苹果果实不同发育阶段,MdNAD-ME1与MdNAD-ME2具有不同的表达模式。以上结果表明,克隆得到的MdNAD-ME1和MdNAD-ME2属于植物NAD-ME,在苹果的生长和发育过程中MdNAD-ME1和MdNAD-ME2可能起到不同作用。
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人抗凝血酶Ⅲ的表达及其抗血清的制备
《细胞与分子免疫学杂志 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：目的用大肠杆菌系统表达重组的抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ),制备其抗血清并测定效价。方法利用基因克隆技术获得AT-Ⅲ基因片段,构建原核表达质粒pET32a(+)-AT-Ⅲ,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达、蛋白纯化并免疫兔,间接ELISA、Western blot法检测抗血清。结果 SDS-PAGE、Western blot法检测原核表达蛋白结果显示,在相对分子质量(Mr)77 000附近出现特异性条带。对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备AT-Ⅲ抗血清,间接ELISA方法检测抗血清的最高效价可达到1∶12 800,Western blot分析表明抗血清可与293T、CHO细胞表达的AT-Ⅲ蛋白及AT-Ⅲ蛋白纯品特异性结合。结论成功制备了人抗凝血酶Ⅲ抗血清。
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绒毛白蜡2个MYB转录因子的活性鉴定及其表达分析
《江西农业大学学报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：绒毛白蜡(Fraxinus velutina Torr.)FvMYB1和FvMYB2基因分别属于R1-MYB和R2R3-MYB转录因子家族成员。通过酵母(Saccharomyces cerevisiae)单杂交系统分别对其转录活性进行了鉴定,并分析了2个基因在不同组织中的表达模式。酵母滤纸显色反应结果表明两个转录因子均能激活下游报告基因(His和LacZ)的表达,具有转录激活功能;β–半乳糖苷酶活性检测法定量分析得出FvMYB1和FvMYB2的半乳糖苷酶活性分别为14.55 U和20.80 U。组织特异性分析显示,两者在各组织(根、子叶、茎、叶)中均有表达,但各自又表现出不同的组织表达差异,其中FvMYB1基因在茎中表达量最高,根中最低;而FvMYB2基因在各组织中的表达量无明显差异。
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人MxA基因的原核表达及其抗血清的制备
《中国畜牧兽医 》 2013 北大核心
摘要：本试验旨在利用大肠杆菌BL21(DE3)表达MxA融合蛋白pET32a(+)-MxA,制备兔抗人MxA抗血清。采用PCR技术获得MxA基因,然后将MxA基因重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21(DE3)培养物,纯化蛋白质后免疫新西兰兔制备抗血清。SDS-PAGE分析结果显示,pET32a(+)-MxA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以包涵体形式高效表达;获得的抗血清经间接ELISA法检测效价为1∶6400;West-ern blotting检测结果显示,抗血清可与真核表达的MxA蛋白进行特异性结合。试验结果表明,在大肠杆菌中成功表达了pET32a(+)-MxA融合蛋白,制备了具有高度特异性的兔抗人MxA抗血清,这样为采用酶标法测定病毒患者全血细胞或由干扰素诱导的细胞产生的MxA蛋白质含量及临床诊断试剂盒的开发和应用打下了基础。
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小立碗藓Ran基因的克隆与表达分析
《山东农业科学 》 2013
摘要：Ran是一种大量分布于细胞核内的小分子的GTP酶,在核质运输过程中具有十分重要的作用,参与调控细胞分裂及其信号传导。本研究利用基于同源序列的PCR技术,从小立碗藓(Physcomitrella patens)中成功克隆了PpRan基因的开放阅读框(ORF)序列,并对其编码的氨基酸序列进行了相关分析。利用半定量PCR技术对PpRan基因在不同组织中以及受到缺磷胁迫时的表达研究发现,PpRan基因的表达具有组织特异性,茎叶体和原丝体中表达量较高,假根中表达量比较低;PpRan基因受缺磷胁迫诱导表达,随着胁迫时间的延长表达量越来越高。这些结果表明,PpRan基因可能在小立碗藓响应缺磷胁迫时发挥重要作用。
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