科研产出
拟南芥SHORT-ROOT基因稀有密码子分析及其在原核细胞中的表达和纯化
《生物技术通讯 》 2016
摘要：目的:在大肠杆菌中重组表达拟南芥SHORT-ROOT(SHR)蛋白并纯化。方法:将SHR基因编码区克隆至p GEX-4T-2表达载体,构建重组质粒p GEX-4T-2-SHR并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),表达产物经谷胱甘肽亲和层析凝胶4B分离纯化,SDS-PAGE分析和Western印迹鉴定。结果:SHR融合蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的86×103,且经Western印迹确证。结论:获得了拟南芥SHR融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。
关键词： 拟南芥 SHORT-ROOT蛋白 稀有密码子 原核表达 纯化
全文链接
请求原文
鸡干扰素刺激基因12(ISG12)的克隆表达及抗病毒活性分析
《中国兽医学报 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：干扰素刺激基因12(interferon-stimulated gene 12,ISG12)在病毒感染过程中已经被监测到,但是针对其抗病毒活性的研究却很少。本研究的主要目的是体外表达鸡的ISG12基因,以禽流感病毒(avian influenza viru,AIV)1215株为病毒模型,利用细胞培养检测其抗病毒活性。利用RT-PCR方法扩增鸡胚成纤维细胞(CEF)的ISG12基因,经测序分析,该基因序列与GenBank中登录的禽属ISG12基因序列相似性为100%。将该基因亚克隆至pET-32a载体构建重组原核表达质粒p32a-C12;工程菌p32a-C12/BL21经IPTG诱导表达,重组蛋白经Ni 2+琼脂糖凝胶柱层析纯化,获得相对分子质量约30 000的目的蛋白。利用ISG12蛋白预处理CEF和鸡外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)后感染AIV 1215株,或者将该病毒与ISG12蛋白一起接种CEF细胞和PBL细胞,AIV在CEF中的复制能力与对照组无明显差异,而ISG12蛋白预处理鸡PBL细胞和同时感染AIV 1215株时的病毒含量均比对照低。体外抗病毒活性试验表明,ISG12蛋白能够抑制AIV 1215株在PBL细胞中的复制,但在CEF细胞上的作用不明显。
全文链接
请求原文
PEPC基因在高油品种吉花4号及其亲本中的表达比较
《花生学报 》 2015
摘要：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是控制花生蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶。本研究利用荧光定量PCR(Quantitative Real-time RT-PCR)方法,检测了PEPC家族5个基因(AhPEPC1、AhPEPC2、AhPEPC3、AhPEPC4和AhPEPC5)在高油品种吉花4号及其两个亲本种子发育过程中的表达情况。结果显示,在种子发育的前期,吉花4号中AhPEPC1~4基因的表达量低于其父本唐油4号中AhPEPC1~4基因的表达量。AhPEPC5基因的表达量在吉花4号和唐油4号种子发育前期差异不大,但在果针入土后65d,唐油4号中AhPEPC5基因的表达量明显高于吉花4号。
全文链接
请求原文
聚肌胞浓度和免疫刺激时间对猪外周血单核细胞基因表达的影响
《中国农业科学 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：【目的】聚肌胞(Poly I:C)是聚肌苷酸和聚胞苷酸的共聚物,能够模拟病毒感染后所形成的ds RNA,刺激机体产生抗病毒免疫反应和炎症反应。利用Poly I:C作为免疫刺激剂对猪外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)的免疫刺激试验中Poly I:C的最佳作用浓度和体外免疫刺激培养时间的研究还未见报道。本研究探讨不同的Poly I:C免疫剂量和免疫刺激时间对猪PBMC各细胞因子和受体基因表达的影响,确定Poly I:C进行免疫试验的最佳作用浓度和体外免疫刺激培养时间,为利用Poly I:C进行RNA病毒感染的免疫应答调控机理研究提供试验依据。【方法】以长白仔猪为研究对象,利用分离的PBMC和1﹕5稀释的EDTA-抗凝血,设置Poly I:C浓度梯度(0、10、20和40μg·m L-1)和不同的体外免疫刺激培养时间(4、8、12和24 h),通过荧光定量PCR方法测定Poly I:C免疫刺激下机体激活或者诱导表达的主要细胞因子(IL6,IL8,TNFα,IL10,IRF3,IFNα和IFNγ)和模式识别受体(TLR3和TLR4)的相对表达量,分析利用Poly I:C对猪全血和PBMC进行免疫刺激试验的最佳作用浓度和时间。【结果】猪PBMC中细胞因子和受体基因的表达量受Poly I:C浓度和免疫刺激时间的影响。各基因具有特征性的表达量变化曲线,达到最高表达变化倍数的浓度和体外培养时间各不相同。对于两个干扰素基因IFNα和IFNγ,最高表达量出现在Poly I:C免疫刺激培养4 h,而后随着培养时间的延长表达量逐渐降低,而其他5个细胞因子(IL6,IL8,TNFα,IL10和IRF3)和2个模式识别受体(TLR3和TLR4)基因随着Poly I:C浓度的增加和免疫刺激时间的延长变化倍数逐渐增加,在Poly I:C浓度为20-40μg·m L-1,免疫刺激时间为12-24 h达到最高表达量。但是,对于最高表达量出现在浓度20μg·m L-1和培养时间12 h的基因,其在浓度为40μg·m L-1和培养时间24 h表达变化量只有小幅下降。另外本研究还对比检测了1﹕5稀释血在Poly I:C免疫刺激下主要细胞因子和受体的表达变化,结果表明全血中各细胞因子和受体的整体表达变化倍数比PBMC低很多,特别是对于IL6和IL8这两个PBMC中表达变化很大的基因,全血中表达变化量不仅很小,而且变化趋势相反。相对于PBMC,稀释全血完整地保存了机体的原始状态,但是利用全血进行免疫试验的主要缺点是抗凝剂保留在全血中。研究中EDTAK2抗凝剂能与血液中的钙离子结合成为螯合物,从而阻止血液凝固,但是钙离子是细胞的重要信号分子,钙离子与EDTA的结合对后续的细胞功能可能产生一定的影响。另外,全血中的某些化合物与血浆蛋白的等成分可能参与免疫细胞对Poly I:C免疫刺激的调节,减少了对Poly I:C免疫刺激的应答。【结论】(1)综合分析所检测的细胞因子和受体的变化趋势,利用Poly I:C进行猪PBMC免疫刺激试验的最佳浓度和体外培养时间分别为20μg·m L-1和24 h。(2)1﹕5稀释的EDTA-抗凝血对Poly I:C免疫反应反应小,与PBMC对Poly I:C免疫应答有不同的应答反应趋势。
关键词： 猪 聚肌胞(Poly I:C) 外周血单核细胞(PBMC) 基因表达
全文链接
请求原文
花生中一个NBS-LRR类基因的克隆和表达分析
《山东农业科学 》 2015
摘要：本研究利用同源克隆方法,根据已知植物抗病(R)基因保守结构域设计一对简并引物,采用RTPCR方法对花生抗旱品种J11进行扩增,获得了一个通读的NBS-LRR类基因片段,命名为PDR1。PDR1长度为474 bp,核苷酸比较分析表明,PDR1与已克隆的大豆抗性基因(XM006573278)相似性为75%,与豌豆(AF123699)、苜蓿(XM003604518)抗性基因的相似性为74%;生物信息学预测其全长CDS编码框为5 838bp,编码的蛋白质含1 945个氨基酸,含有NB-ARC等保守结构域。荧光定量PCR分析表明,PDR1基因在花生幼苗根、茎、叶中均有表达,相对表达量为叶>根>茎;干旱胁迫后PDR1的相对表达量在12 h达到顶峰,随后下降,趋于平稳。本研究从花生中成功获得了NBS-LRR类基因的同源序列,为筛选新的抗旱花生种质提供了理论依据。
关键词： 花生 NBS-LRR 同源序列 基因克隆 表达分析
全文链接
请求原文
花生光敏色素AhphyA和AhphyB基因的克隆及原核表达研究
《四川农业大学学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆了花生(Arachis hypogaea L.)的2个光敏色素基因,并对其进行生物信息学分析,构建这2个基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达蛋白,为进一步纯化蛋白制备抗体以及研究这2个基因在花生发育中的作用奠定基础。【方法】首先,根据花生转录组中编码光敏色素A基因与光敏色素B基因的部分序列,以花生叶片中提取的总RNA为模板,通过RT-PCR与RACE技术对这2个基因的全长ORF序列进行克隆;然后,使用MEGA软件分析花生光敏色素与其他物种中光敏色素的亲缘关系;构建AhphyA、AhphyB的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21并诱导蛋白表达。【结果】2个基因全长ORF分别为3378bp和3 456bp,分别编码1 125和1 151个氨基酸的蛋白;其氨基酸序列与大豆的光敏色素A蛋白和光敏色素B蛋白的相似性分别为88%和90%;经SDS-PAGE检测,在大肠杆菌中2个基因均能受IPTG诱导表达产生蛋白。【结论】利用RT-PCR与RACE技术从花生中克隆得到了2个光敏色素基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。
全文链接
请求原文
鸭甲肝病毒1型和3型间接ELISA方法的建立与应用
《微生物学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：【目的】研究鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)1型VP3和3型VP1串联基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测的间接ELISA方法。【方法】设计2对特异性引物,提取鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)的RNA,分别RT-PCR扩增得到714bp的DHAV-1VP3和720bp的DHAV-3 VP1基因,并克隆至p MD18-T载体中,然后依次将DHAV-1 VP3和DHAV-3 VP1定向插入p ET-32a(+)表达载体,获得重组表达载体p ET-1VP3-3VP1,进行IPTG(Isopropyl-beta-D-1-thiogalactopyranoside)诱导表达分析,以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并应用于临床。【结果】经IPTG诱导表达,在大肠杆菌中可稳定、高效地表达DHAV-1VP3-3VP1蛋白。Western blot检测结果表明,表达的重组蛋白与DHAV-1和DHAV-3阳性血清均能发生特异性反应。确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为1.0μg/孔,血清最佳稀释度为1∶200,临界值为OD6 50值≥0.38,建立的间接ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。该方法与中和试验分别检测DHAV-3阳性血清,两种方法的符合率各为96.3%和96.7%;初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测。【结论】以大肠杆菌表达的DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白建立的间接ELISA方法可用于DHAV-1和DHAV-3抗体的检测。
关键词： 鸭甲肝病毒1型 鸭甲肝病毒3型 VP1基因 VP3基因 表达
全文链接
请求原文
马铃薯卷叶病毒CP基因水溶性原核表达的研究
《中国蔬菜 》 2015 北大核心
摘要：采用两种策略增强了马铃薯卷叶病毒(PLRV)CP基因的水溶性原核表达。首先,用5种可表达出分子伴侣的质粒分别转化重组菌TOP10(p BAD-LRCP),获得了既含p BAD-LRCP又含分子伴侣质粒的转化子;诱导转化子中PLRVCP基因与分子伴侣基因同时表达,SDS-PAGE结果表明,从转化子提取的水溶性蛋白中有明显的PLRV重组CP条带,即分子伴侣增进了重组CP的水溶性表达。其次,将PLRV-CP基因定向插入p ColdⅠ中构建了该基因的冷激诱导原核表达载体p Cold-LRCP,15℃、IPTG诱导24h,SDS-PAGE分析表明,从重组菌BL21(p Cold-LRCP)提取的上清蛋白中有明显的PLRV重组CP条带。试验结果表明,分子伴侣与冷激蛋白基因csp A的启动子均可提高PLRV-CP基因的水溶性表达,且后者的表达水平高于前者。
关键词： 马铃薯卷叶病毒 CP基因 分子伴侣 冷激蛋白启动子 原核表达 重组蛋白 水溶性
全文链接
请求原文
苹果生长素响应因子(ARF)基因家族全基因组鉴定及表达分析
《植物生理学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：生长素响应因子(auxin response factor,ARF)基因在调控生长素响应基因和生长素信号转导途径以及其它多个生长发育过程具有重要作用。本研究利用Blast P程序比对并获得苹果ARF基因家族,通过DNAMAN 6.0、MEGA 5.0、Web Logo3、Map Inspect和MEME软件对苹果ARF基因进行分析,采用RT-PCR技术研究基因组织表达情况。结果表明,苹果基因组存在29个ARF基因,进化上可分为I、II、III、IV和V组,每组成员数目分别是4、5、10、6和4个。内含子和外显子结构分析表明,该基因家族由2~15个外显子构成。染色体分布结果显示,Md ARF基因在染色体上分布不均匀。分别鉴定出4对和2对Md ARF基因经历了串联复制和片段复制,14个Md ARF基因经历了全基因组复制。保守元件分析表明,苹果ARF基因家族DBD区域、ARF区域、III元件和IV元件结构高度保守。半定量结果表明,大多数Md ARF基因在根、茎、叶、花和果中均有表达。
全文链接
请求原文
仔猪外周血中内参基因的筛选及细胞因子和受体的表达水平
《中国农业科学 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：【目的】中国地方猪种在抗病性和免疫力方面优于国外猪种,但是对中外猪种抗病力差异的遗传基础和免疫机理却了解甚少。有推测不同品种猪对疾病的抵抗力不同可能在细胞因子和受体的表达水平上有所反映。本研究以抗病力强的大蒲莲和抗病力相对较弱的长白猪的断奶仔猪为研究对象,对6个具有重要功能的细胞因子(促炎症细胞因子(IL8和TNFα),抗炎症细胞因子(IL10),干扰素调节因子(IRF3)和干扰素(IFNA和IFNG))和1个最具代表性的模式识别受体(TLR4)基因在大蒲莲和长白仔猪群体外周血液中的基因表达量进行检测,并对各基因进行品种和母猪效应分析,为了解中外不同猪种的免疫水平奠定基础。【方法】采集大蒲莲(104头)和长白(171头)35日龄仔猪的外周血,提取总RNA,逆转录为c DNA后,利用荧光定量PCR法,首先对6个常用的候选内参基因(ACTB、GAPDH、B2M、TBP、RPL4和PPIA)利用ge Norm软件进行稳定性评价分析,筛选仔猪外周血RNA基因定量分析中稳定表达的内参基因,然后利用该内参基因进行校正,对上述细胞因子和模式识别受体基因在大蒲莲和长白仔猪群体外周血中的表达量进行定量,并利用最小二乘法对细胞因子和受体在大蒲莲和长白仔猪群体中的表达量进行品种和母猪效应分析。【结果】研究结果归纳为4个方面:1.外周血样品中内参基因稳定性值M从大到小依次为:ACTB(0.595)>GAPDH(0.571)>PPIA(0.469)>RPL4(0.466)>TBP(0.461)>B2M(0.440),选择表达稳定性最高的基因B2M作为内参基因对细胞因子和受体基因的表达量进行校正。2.检测的6个细胞因子的基因表达量存在很大的差异,各细胞因子基因表达量ΔCt最大值和最小值之间差值分别为9.23—14.25和5.83—8.73;受体TLR4的ΔCt值的最大和最小值之间相差相对较小,大蒲莲和长白仔猪分别为5.03和3.82。3.大蒲莲和长白两品种间相比较,细胞因子在长白猪群体中的表达量平均值均高于大蒲莲群体,而受体TLR4的基因表达量在长白猪群体中的表达量低于大蒲莲群体;而且,大蒲莲群体内个体间细胞因子和受体表达量变异系数(平均31.43%)要大于长白群体(平均19.10%),这与大蒲莲选育程度低,群体内个体间的差异程度要大相一致。4.品种效应分析表明除IL10外,其他6个目的基因的ΔCt值品种间差异达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)水平。母猪效应分析表明母猪对各细胞因子和受体的影响均达到了极显著水平(P<0.01)。【结论】成功筛选了外周血基因表达分析中稳定表达的内参基因(B2M),对常规饲养管理下大蒲莲和长白仔猪外周血中的主要细胞因子和受体基因的表达进行群体水平分析。本研究结果为了解中外不同猪种的种质特性和抗病品种的选育提供了基础数据。
关键词： 细胞因子 模式识别受体 基因表达 大蒲莲 长白 仔猪
全文链接
请求原文
