科研产出
鸡干扰素刺激基因12(ISG12)的克隆表达及抗病毒活性分析
《中国兽医学报 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：干扰素刺激基因12(interferon-stimulated gene 12,ISG12)在病毒感染过程中已经被监测到,但是针对其抗病毒活性的研究却很少。本研究的主要目的是体外表达鸡的ISG12基因,以禽流感病毒(avian influenza viru,AIV)1215株为病毒模型,利用细胞培养检测其抗病毒活性。利用RT-PCR方法扩增鸡胚成纤维细胞(CEF)的ISG12基因,经测序分析,该基因序列与GenBank中登录的禽属ISG12基因序列相似性为100%。将该基因亚克隆至pET-32a载体构建重组原核表达质粒p32a-C12;工程菌p32a-C12/BL21经IPTG诱导表达,重组蛋白经Ni 2+琼脂糖凝胶柱层析纯化,获得相对分子质量约30 000的目的蛋白。利用ISG12蛋白预处理CEF和鸡外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)后感染AIV 1215株,或者将该病毒与ISG12蛋白一起接种CEF细胞和PBL细胞,AIV在CEF中的复制能力与对照组无明显差异,而ISG12蛋白预处理鸡PBL细胞和同时感染AIV 1215株时的病毒含量均比对照低。体外抗病毒活性试验表明,ISG12蛋白能够抑制AIV 1215株在PBL细胞中的复制,但在CEF细胞上的作用不明显。
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花生中巨大芽孢杆菌对黄曲霉毒素合成相关基因的抑制
《浙江大学学报(农业与生命科学版) 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：分别在UF 715133-1和Jinhua 1012花生仁上接种黄曲霉和巨大芽孢杆菌,高压液相色谱法测定花生中黄曲霉毒素含量,借助生物芯片和实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR)测定巨大芽孢杆菌对黄曲霉毒素生物合成途径基因表达的影响,并用基因本体(gene ontology,GO)功能分类和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路方法对基因进行分类分析。在实验组Jinhua 1012和UF 715133-1中,黄曲霉毒素B1的含量降低了85%以上,一些编码蛋白质酶的基因显著下调,如短链脱氢酶、非核糖体多肽合成酶等。结果表明,从海洋中分离出的巨大芽孢杆菌可显著抑制黄曲霉毒素在花生上的合成,黄曲霉中多种基因的表达受到抑制,但这些基因在黄曲霉毒素生物合成中的作用并未阐明,其作用机制还有待进一步深入研究。
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聚肌胞浓度和免疫刺激时间对猪外周血单核细胞基因表达的影响
《中国农业科学 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：【目的】聚肌胞(Poly I:C)是聚肌苷酸和聚胞苷酸的共聚物,能够模拟病毒感染后所形成的ds RNA,刺激机体产生抗病毒免疫反应和炎症反应。利用Poly I:C作为免疫刺激剂对猪外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)的免疫刺激试验中Poly I:C的最佳作用浓度和体外免疫刺激培养时间的研究还未见报道。本研究探讨不同的Poly I:C免疫剂量和免疫刺激时间对猪PBMC各细胞因子和受体基因表达的影响,确定Poly I:C进行免疫试验的最佳作用浓度和体外免疫刺激培养时间,为利用Poly I:C进行RNA病毒感染的免疫应答调控机理研究提供试验依据。【方法】以长白仔猪为研究对象,利用分离的PBMC和1﹕5稀释的EDTA-抗凝血,设置Poly I:C浓度梯度(0、10、20和40μg·m L-1)和不同的体外免疫刺激培养时间(4、8、12和24 h),通过荧光定量PCR方法测定Poly I:C免疫刺激下机体激活或者诱导表达的主要细胞因子(IL6,IL8,TNFα,IL10,IRF3,IFNα和IFNγ)和模式识别受体(TLR3和TLR4)的相对表达量,分析利用Poly I:C对猪全血和PBMC进行免疫刺激试验的最佳作用浓度和时间。【结果】猪PBMC中细胞因子和受体基因的表达量受Poly I:C浓度和免疫刺激时间的影响。各基因具有特征性的表达量变化曲线,达到最高表达变化倍数的浓度和体外培养时间各不相同。对于两个干扰素基因IFNα和IFNγ,最高表达量出现在Poly I:C免疫刺激培养4 h,而后随着培养时间的延长表达量逐渐降低,而其他5个细胞因子(IL6,IL8,TNFα,IL10和IRF3)和2个模式识别受体(TLR3和TLR4)基因随着Poly I:C浓度的增加和免疫刺激时间的延长变化倍数逐渐增加,在Poly I:C浓度为20-40μg·m L-1,免疫刺激时间为12-24 h达到最高表达量。但是,对于最高表达量出现在浓度20μg·m L-1和培养时间12 h的基因,其在浓度为40μg·m L-1和培养时间24 h表达变化量只有小幅下降。另外本研究还对比检测了1﹕5稀释血在Poly I:C免疫刺激下主要细胞因子和受体的表达变化,结果表明全血中各细胞因子和受体的整体表达变化倍数比PBMC低很多,特别是对于IL6和IL8这两个PBMC中表达变化很大的基因,全血中表达变化量不仅很小,而且变化趋势相反。相对于PBMC,稀释全血完整地保存了机体的原始状态,但是利用全血进行免疫试验的主要缺点是抗凝剂保留在全血中。研究中EDTAK2抗凝剂能与血液中的钙离子结合成为螯合物,从而阻止血液凝固,但是钙离子是细胞的重要信号分子,钙离子与EDTA的结合对后续的细胞功能可能产生一定的影响。另外,全血中的某些化合物与血浆蛋白的等成分可能参与免疫细胞对Poly I:C免疫刺激的调节,减少了对Poly I:C免疫刺激的应答。【结论】(1)综合分析所检测的细胞因子和受体的变化趋势,利用Poly I:C进行猪PBMC免疫刺激试验的最佳浓度和体外培养时间分别为20μg·m L-1和24 h。(2)1﹕5稀释的EDTA-抗凝血对Poly I:C免疫反应反应小,与PBMC对Poly I:C免疫应答有不同的应答反应趋势。
关键词： 猪 聚肌胞(Poly I:C) 外周血单核细胞(PBMC) 基因表达
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花生热激蛋白AhHSP70与热激因子AhHSF基因的克隆及表达分析
《山东农业科学 》 2015
摘要：热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)和热激转录因子(heat shock factors,HSFs)在植物热胁迫信号转导和耐热性的产生过程中发挥了重要作用。本研究从花生转录组文库中筛选到HSP70、HSF的c DNA片段,通过序列比对在花生全基因组序列中获得这两个基因的基因组序列,根据序列信息设计引物,以花生叶片c DNA为模板扩增全长ORF并进行生物信息学分析。结果显示,Ah HSP70基因的ORF全长为1 962 bp,编码653个氨基酸,分子质量为71.45 k D,理论等电点p I为4.93;Ah HSF基因的ORF全长为1 212 bp,编码403个氨基酸,分子质量为46.03 k D,理论等电点p I为4.85。Ah HSP70与Ah HSF均不具有信号肽,为可溶性蛋白,二级结构中有大量无规则卷曲。利用这两个基因的氨基酸序列分别与来源于其他物种HSP70、HSF的氨基酸序列进行同源比对,并构建进化树进行亲缘关系分析,结果表明,Ah HSP70与大豆Gm HSP70亲缘关系较近,与番茄Sl HSP70亲缘关系比较远;Ah HSF与菜豆Pa HSF亲缘关系较近,而与蒺藜苜蓿Mt HSF的亲缘关系较远。利用实时荧光定量PCR对Ah HSP70和Ah HSF在热胁迫情况下的表达进行分析,结果表明这两个基因在42℃高温条件下表达量显著升高,Ah HSP70在高温胁迫3 h后表达明显升高,热处理24 h和48 h后,表达量为对照的50倍和135倍;转录因子Ah HSF在高温胁迫3 h后表达明显升高,高温处理6 h后达到最高,随后下降。本研究初步验证了花生热激蛋白和热激因子基因在花生响应高温胁迫中的作用。
关键词： 花生 热激蛋白 热激因子 基因克隆 序列分析 基因表达
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棉花GhSRO04/GhSRO08基因的克隆及表达分析
《分子植物育种 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：SRO转录因子在植物响应盐、旱和病菌等生物和非生物胁迫中具有重要的调节作用。本研究从抗枯萎病耐黄萎病的棉花品种鲁研棉32号中克隆获得2个基因:命名为GhSRO04和GhSRO08(Gen Bank登录号为KR534896和KR534895)。结果显示:GhSRO04包含一个最大开放阅读框1830 bp(ORF),推测编码609个氨基酸;GhSRO08包含一个最大开放阅读框1 842 bp(ORF),推测编码编码613个氨基酸。比对分析表明GhSRO04和GhSRO08基因均含有RCD1-SRO-TAF4结构域(RST)。系统进化树分析表明,GhSRO04和GhSRO08编码产物与拟南芥RCD1和SRO1亲缘关系最近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析基因表达显示,GhSRO04和GhSRO08基因均受黄萎病菌侵染、干旱和高盐诱导表达,表明GhSRO04和GhSRO08在棉花应对盐、旱和病菌胁迫中可能起着重要的调节作用,对棉花种质的抗逆性遗传改良具有潜在利用价值。本研究首次从棉花中分离鉴定出SRO类转录因子,并进行了初步功能分析,为棉花遗传改良储备了基因资源。
关键词： 棉花 GhSRO04/GhSRO08 SRO 基因表达 抗逆
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仔猪外周血中内参基因的筛选及细胞因子和受体的表达水平
《中国农业科学 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：【目的】中国地方猪种在抗病性和免疫力方面优于国外猪种,但是对中外猪种抗病力差异的遗传基础和免疫机理却了解甚少。有推测不同品种猪对疾病的抵抗力不同可能在细胞因子和受体的表达水平上有所反映。本研究以抗病力强的大蒲莲和抗病力相对较弱的长白猪的断奶仔猪为研究对象,对6个具有重要功能的细胞因子(促炎症细胞因子(IL8和TNFα),抗炎症细胞因子(IL10),干扰素调节因子(IRF3)和干扰素(IFNA和IFNG))和1个最具代表性的模式识别受体(TLR4)基因在大蒲莲和长白仔猪群体外周血液中的基因表达量进行检测,并对各基因进行品种和母猪效应分析,为了解中外不同猪种的免疫水平奠定基础。【方法】采集大蒲莲(104头)和长白(171头)35日龄仔猪的外周血,提取总RNA,逆转录为c DNA后,利用荧光定量PCR法,首先对6个常用的候选内参基因(ACTB、GAPDH、B2M、TBP、RPL4和PPIA)利用ge Norm软件进行稳定性评价分析,筛选仔猪外周血RNA基因定量分析中稳定表达的内参基因,然后利用该内参基因进行校正,对上述细胞因子和模式识别受体基因在大蒲莲和长白仔猪群体外周血中的表达量进行定量,并利用最小二乘法对细胞因子和受体在大蒲莲和长白仔猪群体中的表达量进行品种和母猪效应分析。【结果】研究结果归纳为4个方面:1.外周血样品中内参基因稳定性值M从大到小依次为:ACTB(0.595)>GAPDH(0.571)>PPIA(0.469)>RPL4(0.466)>TBP(0.461)>B2M(0.440),选择表达稳定性最高的基因B2M作为内参基因对细胞因子和受体基因的表达量进行校正。2.检测的6个细胞因子的基因表达量存在很大的差异,各细胞因子基因表达量ΔCt最大值和最小值之间差值分别为9.23—14.25和5.83—8.73;受体TLR4的ΔCt值的最大和最小值之间相差相对较小,大蒲莲和长白仔猪分别为5.03和3.82。3.大蒲莲和长白两品种间相比较,细胞因子在长白猪群体中的表达量平均值均高于大蒲莲群体,而受体TLR4的基因表达量在长白猪群体中的表达量低于大蒲莲群体;而且,大蒲莲群体内个体间细胞因子和受体表达量变异系数(平均31.43%)要大于长白群体(平均19.10%),这与大蒲莲选育程度低,群体内个体间的差异程度要大相一致。4.品种效应分析表明除IL10外,其他6个目的基因的ΔCt值品种间差异达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)水平。母猪效应分析表明母猪对各细胞因子和受体的影响均达到了极显著水平(P<0.01)。【结论】成功筛选了外周血基因表达分析中稳定表达的内参基因(B2M),对常规饲养管理下大蒲莲和长白仔猪外周血中的主要细胞因子和受体基因的表达进行群体水平分析。本研究结果为了解中外不同猪种的种质特性和抗病品种的选育提供了基础数据。
关键词： 细胞因子 模式识别受体 基因表达 大蒲莲 长白 仔猪
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花生HIR基因的克隆表达与进化分析
《山东农业科学 》 2014
摘要：过敏性反应是植物抗病机制中最常见的形式之一。过敏性诱导反应(Hypersensitive-induced reaction)基因HIR是与过敏反应相关的一类基因,属于PID家族成员,参与许多细胞生理过程,并与细胞程序化死亡有密切关系。本研究从花生转录组文库中筛选到编码HIR基因的部分序列,通过5'-RACE获得花生HIR基因的全长cDNA序列,并克隆了其基因组序列。分析表明,花生HIR基因与其他物种HIR基因具有高度同源性。对6个物种共17条HIR序列使用最大似然法进行进化分析表明,该基因在进化中受到了强烈的纯化选择作用。qRT-PCR分析发现,该基因的表达量在冷处理4 h时显著降低,随着处理时间延长其表达量逐渐回升;在病菌处理的材料中该基因的表达下调。这些结果为进一步研究HIR基因在花生抗病、耐逆中的功能奠定了基础。
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奶牛COL1A2基因启动子区甲基化与其基因表达及乳腺炎的相关性分析
《江苏农业学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：本研究分析奶牛健康乳腺组织和金黄色葡萄球菌感染的乳房炎乳腺组织中胶原蛋白Ⅰ型α2链基因(COL1A2)启动子区CpG岛甲基化与COL1A2基因表达的调控关系,为奶牛乳房炎的抗性育种及预防提供理论依据。利用生物信息学,分析COL1A2基因启动子区CpG岛分布及其转录因子结合位点;运用亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)和RT-PCR法,分析健康乳腺组织和患乳房炎乳腺组织中,COL1A2基因启动子区的CpG岛甲基化程度与COL1A2基因表达及乳房炎的相关性。结果表明健康乳腺组织和患乳房炎乳腺组织中CpG岛甲基化差异不显著(P>0.05),均呈低甲基化状态(<50%),但位于转录因子SP1结合区域内的第4和第5 CpG位点,健康组甲基化程度(30%和60%)显著高于患乳房炎组(0和10%);健康组基因表达水平显著低于患乳房炎组(P<0.05)。说明,COL1A2基因在不同乳腺组织中的差异表达可能与其启动子区CpG岛转录因子SP1结合区域内的第4和第5CpG位点甲基化程度差异相关。
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蓝莓多酚对巨噬细胞中iNOS、COX-2基因表达的影响
《食品科学 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：RAW264.7巨噬细胞被脂多糖预刺激后,添加从蓝莓中分离制备的不同质量浓度的可萃取多酚(extractable polyphenols,EPP)和不可萃取多酚(non-extractable polyphenols,NEPP),培养不同的时间,研究不同质量浓度及培养时间对诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、环氧合酶(cyclooxygenase-2,COX-2)基因相对表达量的影响。结果表明:从蓝莓中分离的EPP和NEPP均能抑制iNOS、COX-2基因表达,在12h培养时间内,2种多酚的抑制效果较好,且EPP的抑制效果明显好于NEPP。这证明蓝莓中的NEPP同EPP一样,可通过抑制iNOS、COX-2mRNA的表达表现出明显的抗炎活性。
关键词： 蓝莓多酚 巨噬细胞 一氧化氮合酶 环氧合酶 基因表达
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山东省不同时期主推小麦品种的籽粒淀粉合成比较
《植物生理学报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：籽粒淀粉含量对小麦产量和加工品质有重要影响,本实验对1949年以来山东省不同时期8个主要小麦推广品种籽粒灌浆过程中淀粉含量、淀粉合成关键酶活性和酶基因表达的动态变化进行了比较,以期为小麦遗传改良提供理论依据。结果表明,8个小麦品种籽粒总淀粉含量和直、支链淀粉含量随着育成时间的推移表现明显的上升趋势,与籽粒产量的变化一致。籽粒灌浆过程中,淀粉合成关键酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉粒束缚淀粉合酶(GBSS)和淀粉分支酶(SBE)活性及其编码基因相对表达量呈单峰模式,在花后20 d达到顶峰;可溶性淀粉合酶(SSS)花后10 d以后呈缓慢下降的趋势。AGPase和SSS活性及其编码基因相对表达量随着品种育成年代的推移呈上升的趋势,近年选育的‘济南17’和‘济麦22’显著高于其他品种,而GBSS和SBE酶活性及其编码基因表达量变化趋势不明显。相关分析结果表明,AGPase和SSS酶活性及其编码基因表达水平与成熟期籽粒淀粉含量的相关性高于GBSS和SBE酶,说明胚乳淀粉合成在提高小麦籽粒产量方面具有重要作用,AGPase和SSS对淀粉含量的影响可能超过GBSS和SBE。
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