科研产出
奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白配基结合区基因的克隆与原核表达
《中国兽医学报 》 2008 北大核心 CSCD
摘要：运用PCR方法扩增出奶牛乳腺炎分离株10A的Fnbp配基结合区基因,该片段大小为350bp左右,将其与PGEM-T载体连接,转化到受体菌DH5α中,用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板筛选出含有重组子的菌株,鉴定成功后,测序结果表明:奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌10A的Fnbp配基结合区基因的序列与金黄色葡萄球菌Mu50、N315、MSSA476、MW2、RF122、COL以及NCTC8325的相应区域序列同源性分别为97%、97%、95%、95%、96%、94%和94%。将重组克隆载体质粒进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切回收后的DNA,定向插入到融合表达载体PET-32a中,构建了重组质粒PET-Fnbp,并转化到宿主菌BL21(DE3)株中,经IPTG4h诱导后,SDS-PAGE电泳表明,重组蛋白得到高效表达,重组蛋白主要以分泌形式存在,分子量35000左右,Ni柱纯化后的蛋白经Western-blotting检测,具有良好的抗原性和特异性。
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奶牛乳腺炎主要致病菌的分离与鉴定
《家畜生态学报 》 2008
摘要：对山东省济南、泰安和临沂等地区5个奶牛场的160份乳样进行了临床型乳腺炎和隐性乳腺炎的判定检测,并进行了主要致病菌的分离鉴定。结果表明,160份乳样中有127份呈乳腺炎阳性,其中临床型乳腺炎占36.22%,隐性乳腺炎占63.78%;从这些乳样中分离到了主要致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌,金黄色葡萄球菌依据溶血型的不同主要有α溶血、β溶血、α+β溶血和不溶血四种;大肠杆菌依据O抗原诊断血清得出主要有O2、O21、O76和O88这四种型;无乳链球菌依据溶血型主要为β溶血型。
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PCR扩增血浆凝固酶基因检测致病性金黄色葡萄球菌
《生物技术通报 》 2008 北大核心 CSCD
摘要：金黄色葡萄球菌致病株能同时产生两种蛋白质,一种分泌于菌体外,另一种结合在菌体表面,它们能使含有抗凝剂的家兔或人的血浆凝固,称为凝固酶(Coagulase)。凝固酶是检验致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。试验根据GenBank公布的血浆凝固酶序列,设计特异PCR引物,利用聚合酶链式反应扩增出金黄色葡萄球菌凝固酶基因,克隆测序,与Genbank中已公布的序列同源性达到100%,并且检测结果与用兔血浆进行血浆凝固酶实验结果完全吻合,建立了金黄色葡萄球菌性乳腺炎的快速诊断方法。
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双重PCR检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌粘附素clfa A和Fnbp A基因
《中国兽医学报 》 2008 北大核心 CSCD
摘要：利用设计合成的特异性引物对金黄色葡萄球菌进行PCR扩增,将目的基因回收并连接到T载体,鉴定后进行测序验证,然后对本实验室所分离鉴定的临床分离株进行双重PCR检测。结果显示,PCR产物经过电泳成像显示,仅有金黄色葡萄球菌分别在293bp和642bp处出现特异性条带。通过对金黄色葡萄球菌临床分离株双重PCR检测发现,其中95%以上存在粘附素基因clfa A和Fnbp A。证明本试验建立的双重PCR检测金黄色葡萄球菌粘附素基因的方法具有良好的特异性和可靠性。
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金黄色葡萄球菌粘附素Fnbp A功能区基因的克隆和原核表达
《西北农林科技大学学报(自然科学版) 》 2008 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆和表达奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌纤连蛋白连接蛋白A(Fnbp A)的功能基因。【方法】采集奶牛急性乳腺炎乳样,分离金黄色葡萄球菌,提取其DNA作为模板,利用设计合成的特异性引物,对金黄色葡萄球菌进行FnbpA功能基因的PCR扩增。回收目的基因并连接到T载体,鉴定后进行测序,然后将FnbpA基因连接到pET-32a(+)质粒中,经鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导后采用SDS-PAGE分析蛋白质的表达情况。【结果】PCR产物经电泳成像,仅金黄色葡萄球菌在1.7 kb处出现特异性条带,测序发现其与GenBank公布的FnbpA序列的同源性为98%;蛋白诱导表达SDS-PAGE分析发现,在80 ku处出现特异性条带。【结论】试验成功地克隆到FnbpA基因,并在大肠杆菌中获得高效表达,蛋白量为33.4%,为进一步研究金黄色葡萄球菌粘附素基因工程疫苗奠定了基础。
关键词： 金黄色葡萄球菌 乳腺炎 粘附素 纤连蛋白连接蛋白A
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金黄色葡萄球菌α溶血素的原核表达及其生物活性分析
《农业生物技术学报 》 2007 CSCD
摘要：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,以下简称金葡菌)是奶牛乳腺炎的最主要致病菌之一(Bradley,2002),可产生多种毒素和酶。α溶血素(α-hemolysin,α-HL),亦称α毒
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PCR扩增Nuc基因检测奶牛乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌
《家畜生态学报 》 2007
摘要：为建立奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌致病菌株的检测方法,依据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶Nuc基因序列,设计合成特异性引物,通过聚合酶链式反应扩增Nuc基因,并将扩增基因克隆入T载体,进行序列测定,对所分离的奶牛乳腺炎病原菌进行鉴定。结果显示:金黄色葡萄球菌扩增出特异性条带,大小为694bp;其他菌株未出现条带。敏感性检测的最低浓度为1.25×103cfu/mL。本试验所建立的方法具有特异性强、敏感度高的特点。
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多重PCR检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌方法的建立与应用
《畜牧兽医学报 》 2006 北大核心 CSCD
摘要：参照GenBank发表的序列,在金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌16S rRNA与23S rRNA之间的区域设计了3对引物,参照念珠菌和隐球菌的18S rRNA的序列设计1对引物,建立了检测金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌4种乳腺炎主要致病菌的多重PCR方法。参照Skladny的方法制备模拟了细菌感染临床标本。结果表明:本试验建立的多重PCR方法具有较好的特异性,多重PCR方法检测乳样中的金黄色葡萄球菌的细菌最小浓度为104CFU/mL,检测无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌的细菌最小浓度分别为102CFU/mL、103CFU/mL和103CFU/mL。通过对采自临床型乳腺炎(46个)和隐性乳腺炎(167个)动物共计213个乳样分别用传统细菌学培养法和多重PCR方法进行检测,多重PCR对金黄色葡萄球菌和酵母真菌的检测具有更高的检出率(P<0.01),但该方法对无乳链球菌和停乳链球菌的检出率与培养法差异不显著(P>0.05)。
关键词： 多重PCR 乳腺炎 金黄色葡萄球菌 无乳链球菌 停乳链球菌 酵母真菌
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中药黄芪多糖的免疫佐剂作用
《中国畜牧兽医 》 2006
摘要：分别将黄芪多糖提取物、白油-吐温、氢氧化铝作为佐剂制备金黄色葡萄球菌灭活苗混合免疫家兔和奶牛,观察家兔免疫前后血清抗体滴度变化以及攻毒后白细胞数目变化和淋巴细胞百分比变化。对奶牛免疫后测其血清抗体和乳汁中体细胞数变化,结果注射疫苗后乳汁中体细胞数都有所下降,黄芪多糖组较其它组下降较快,幅度较大。黄芪多糖和抗原混合物免疫动物后未见不良反应,且抗原免疫血清抗体比氢氧化铝和白油-吐温佐剂组的抗体滴度增加快,幅度显著增高且抗体维持一个较高水平,而攻毒后家兔白细胞数和淋巴细胞数也较氢氧化铝和白油-吐温佐剂组增加较多。因此黄芪多糖是一种有效的佐剂。
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