科研产出
平榛脱水素基因的克隆与表达分析
《园艺学报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：以平榛(Corylus heterophylla Fisch.)花芽为试材,采用 RT-PCR 和 RACE 方法克隆了一个平榛与脱水素基因同源的 cDNA 基因,命名为 ChDHN(GenBank 登录号 HM228389),其全长 639 bp,具有一个 504 bp 的潜在编码区,编码 167 个氨基酸组成的多肽,具有 LEA 类家族成员具有的特征多肽序列,属于 Y4SK2类型 DHN 基因,预测 ChDHN 蛋白质分子量 18.03 kD,预测其理论等电点为 7.28。对ChDHN 的时空表达特性进行了研究,以 Actin 为内参,对 ChDHN 在 4 ℃冷激条件下(0、2、4、8、24和 48 h)的表达模式进行了初步的研究,冷激处理后 ChDHN 表现逐渐上调的表达趋势,24 h 达到最大表达量,48 h 表达量降低;推测 ChDHN 属于植物冷适应调节网络中的应答基因;定量 RT-PCR 分析 ChDHN在不同器官中的表达,在种子中高丰度表达,其次是雄花序和花芽,在树皮中表达最低。用 PCR、酶切和测序鉴定等方法检测已成功构建重组表达载体 pET-32a(+)-DHN,将鉴定完全正确的重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3),经 SDS-PAGE 分析并经过 Western blotting 鉴定,表明重组蛋白被 IPTG 诱导后高效表达出一条比预测分子量 18.03 kD 大 4 kD 的融合蛋白。
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小麦胚乳14-3-3基因的克隆及其重组蛋白的原核表达
《中国农业科学 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆小麦籽粒胚乳14-3-3基因,并进行体外表达,为进一步研究其对籽粒生长发育的调控作用奠定基础。【方法】根据已有同源基因保守序列,设计插入限制性酶切位点的特异性扩增引物,采用RT-PCR方法扩增发育的小麦胚乳14-3-3基因,克隆测序后转入表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并进行纯化。【结果】从开花后灌浆13—15 d的小麦品种济麦22籽粒胚乳中克隆到1个14-3-3基因,序列分析表明为非ε型,含1个777 bp的开放阅读框,编码蛋白259 aa,分子量约29 kD。核苷酸序列分析表明与小麦、水稻、玉米、大麦、大豆等主要农作物和模式植物拟南芥的14-3-3基因有较高的同源性,最高达98%,编码蛋白氨基酸长度也一致(260aa左右);在大肠杆菌中高效表达的重组蛋白约为30 kD,分子量大小与根据核苷酸序列推导的编码蛋白一致。从基因序列的同源性、编码蛋白的氨基酸长度、表达蛋白的分子量大小分析都说明克隆到的基因为14-3-3基因,并准确插入表达载体,得到了高效正确表达。将克隆的基因插入pET29c载体,热激转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP,得到了高效表达,但主要以包涵体形式(80%)存在。对重组蛋白进行了纯化,可溶性重组蛋白利用S-蛋白琼脂糖树脂得到纯化的蛋白,包涵体重组蛋白经变性溶解、复性后,也利用S-蛋白琼脂糖树脂得到了高度纯化的重组蛋白。【结论】利用RT-PCR技术从发育的小麦胚乳中克隆到1个14-3-3基因,并在大肠杆菌中得到了高效表达,重组蛋白经过纯化得到了纯度较高的活性蛋白。
关键词： 小麦 14-3-3蛋白 基因克隆 重组蛋白 原核表达
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樱桃病毒A外壳蛋白基因克隆及其原核表达
《中国农学通报 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：为制备樱桃病毒A(Cherry virusA,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5mmol/L IPTG、诱导4h条件下表达量最大。
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马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因的原核表达及抗血清的制备
《园艺学报 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：利用RT-PCR扩增马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白(CP)基因(PLRV-CP),回收大小约630bp的特异性扩增片段并进行T-A克隆,测序表明该基因长度为627bp,与已报道的36个PLRV-CP基因的核苷酸序列的同源性大于96%。以pBAD/Thio-TOPO为起始载体,构建了PLRV-CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP。以pBAD-LRCP为模板,用PCR法删除了该基因富含精氨酸稀有密码子的第52～177核苷酸,获得了PLRV缺失突变CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP-126。用阿拉伯糖诱导工程菌TOP10(pBAD-LRCP-126),获得了34kD的诱导表达的融合蛋白(重组CP)。用镍离子亲和层析法从包涵体中纯化出了高纯度的重组CP,用纯化的重组CP作抗原免疫家兔获得了PLRV特异性的抗血清,间接ELISA检测显示效价为1︰12800。本研究结果为利用重组CP作抗原大量制备PLRV抗血清奠定了基础。
关键词： 马铃薯卷叶病毒 CP基因 缺失突变 原核表达 抗血清
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植物法呢基焦磷酸合酶基因(FPPS)研究进展
《农业生物技术学报 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：植物法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS)是甲羟戊酸代谢途径分支点的关键酶,参与叶绿素、类胡萝卜素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、长萜醇、类萜、辅酶Q、甾醇和植物毒素等类异戊二烯物质的合成,而类异戊二烯是维持植物生长发育等所必需的重要有机物质。本文综述了植物法呢基焦磷酸合酶基因克隆、基因表达、酶动力学研究等方面的重要进展,旨在为其在植物进化分类、遗传改良中的应用提供参考。
关键词： 植物 类异戊二烯 法呢基焦磷酸合酶(FPPS) 基因克隆 基因表达
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曲霉来源植酸酶基因phyA的克隆及原核表达
《山东农业科学 》 2012
摘要：在饲料中添加植酸酶可以提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收,并减轻动物排泄物中磷对环境的污染,具有广泛的应用前景。本试验以自行分离得到的黑曲霉菌株基因组DNA为模板,克隆得到植酸酶phyA基因,并将其连接到原核表达载体pET21b、pET30a上,利用热激转化的方法将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建植酸酶大肠杆菌工程菌株。工程菌株在经诱导后可以产生大量的植酸酶蛋白。
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中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2 cDNA的克隆与原核表达
《中国畜牧兽医 》 2012 北大核心
摘要：本试验旨在克隆并表达中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2,MD-2)基因,并用West-ern blotting进行鉴定。采用RT-PCR技术从中国荷斯坦奶牛外周血白细胞中扩增MD-2cDNA,并将扩增产物与pMD20-T载体连接,重组质粒经测序鉴定后,构建pET28a-MD-2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明,目的基因含有1个483bp的开放阅读框,编码161个氨基酸;与黄牛、黑猩猩和小鼠MD-2的cDNA序列同源性分别为99.38%、77.02%、68.12%,氨基酸同源性分别为98.75%、65.00%和58.13%。融合蛋白以包涵体的形式存在,分子质量约为25ku。说明本研究成功克隆并表达了中国荷斯坦奶牛MD-2cDNA,为其进一步的功能研究提供了理论依据。
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花生C4H和ANR基因的克隆与表达研究
《核农学报 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：通过构建花生未成熟种子cDNA文库,结合大规模EST测序,首次从花生中克隆了原花青素代谢途径上的2个关键酶[肉桂酸-4-羟化酶(C4H)和花青素还原酶(ANR)]基因的全长编码序列。序列分析表明,与其他植物的C4H相比,花生C4H整个编码区高度保守,开放阅读框长度1518bp,编码蛋白长度505个氨基酸,预测的蛋白分子量为57.9kDa,等电点为9.04。花生中ANR开放阅读框长度966bp,编码蛋白长度321个氨基酸,预测的蛋白分子量为35kDa,等电点为8.31。亚细胞定位预测分析表明,C4H定位在线粒体中,ANR则定位在胞外。半定量RT-PCR结果表明,C4H在花生根、茎、叶、花、果针、种子中均有表达,但在茎、叶中表达相对较低,而原花青素合成途径中的关键酶ANR在各个组织中均有表达,其中在果针中表达最强。
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ScMYB原核蛋白诱导表达的影响因素研究(英文)
《Agricultural Science & Technology 》 2012
摘要：[目的]探讨ScMYB原核蛋白诱导表达的影响因素,优化表达条件。[方法]构建了ScMYB::pEASY-E1原核表达载体,研究了诱导剂IPTG浓度、诱导时间、温度及菌体浓度对该蛋白表达的影响。[结果]诱导剂IPTG浓度对表达量影响不大,而与诱导时间、温度及菌体浓度均有关。[结论]在37℃,诱导4h及OD600达0.6-1.0时,ScMYB原核蛋白诱导表达量最大。
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人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)(1354-1802)的原核表达及抗血清制备
《安徽农业科学 》 2012 北大核心
摘要：[目的]制备人组织型纤溶酶原激活剂t-PA(1354-1802)抗血清,并测定其效价,为深入研究t-PA基因功能奠定基础。[方法]利用基因克隆技术获得t-PA(1354-1802)催化域基因片段,然后将其重组到pET-32a(+)质粒中,进行鉴定及序列分析;将测序正确的阳性质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导、蛋白纯化及免疫兔试验。[结果]SDS-PAGE结果显示,37 kD处出现特异性条带;对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备t-PA蛋白抗血清,Western blot分析表明,抗血清可与标准品t-PA蛋白特异性结合,间接ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶12 800。[结论]成功制备了t-PA(1354-1802)抗血清,为t-PA基因功能的深入研究奠定了基础。
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