副猪嗜血杆菌环介导等温扩增检测方法的建立及应用

李璐璐; 骆延波; 张庆; 赵效南; 任金瑞; 胡明; 张印; 齐静; 刘玉庆; 《山东农业科学 》 2020

摘要：本试验针对副猪嗜血杆菌的16S rRNA基因设计环介导等温扩增(LAMP)引物,建立副猪嗜血杆菌LAMP方法,并进行特异性和灵敏度试验.结果显示,建立的LAMP检测方法特异性良好,与其它5种细菌无交叉反应,灵敏度为10-4 ng/μL.分别使用LAMP和PCR方法对30份临床采集样品进行检测,阳性检出率均为40%,符合率100%.本试验建立的LAMP检测方法不需要特殊的仪器设备,可用于副猪嗜血杆菌的鉴定.

关键词： 副猪嗜血杆菌 环介导等温扩增 快速检测

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副猪嗜血杆菌脂多糖的提取、鉴定及初步应用

杨杰; 李建达; 丛晓燕; 杨胜男; 任素芳; 郭立辉; 陈智; 陈蕾; 曾昊; 孙文博; 时建立; 李俊; 邱文彬; 吴家强; 于江; 《中国动物检疫 》 2018

摘要：为建立一种有效提取高纯度副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)的方法,进一步阐明HPS的致病机制,通过热酚水法提取LPS,浓缩后,采用酶解法和超离法纯化提取物,分别用硫酸-苯酚法、BCA法、紫外分光光度法,测定LPS提取物中多糖、蛋白及核酸的含量,通过SDSPAGE电泳银染方法鉴定提取物。将提取的LPS作用于猪肺泡巨噬细胞,通过荧光定量方法检测IL-1β的表达量差异。结果显示:纯化的LPS平均产率为2.56%;LPS提取物中不含还原性单糖,多糖含量为3.27%,蛋白含量为0.77%,核酸含量为0.90%;提取的LPS能够引起猪肺泡巨噬细胞IL-1β表达量显著上调。因此,通过该方法提取纯化的LPS可以用于HPS与宿主细胞间作用机制的研究。

关键词： 副猪嗜血杆菌 脂多糖 提取 鉴定

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山东省副猪嗜血杆菌分子流行病学调查及其外膜蛋白P2基因的表达纯化

杨杰; 李建达; 曾昊; 任素芳; 郭立辉; 孙文博; 陈智; 丛晓燕; 于江; 吴家强; 《中国动物传染病学报 》 2018

摘要：根据副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)外膜蛋白(outer membrane proteins,Omp)P2基因序列(GenBank登录号:FJ685754.1)设计引物,对2015~2016年在山东省不同地区采集的225份病料进行PCR扩增和遗传演化分析,结果发现2015年和2016年Hps检出阳性率分别为7.63%、7.48%,细菌分离确定225份样品中17份为阳性;Hps菌株之间的氨基酸同源性在86.7%~99.7%,同源性较高的蛋白具有交叉反应性.构建Hps ompP2基因原核表达载体,确定OmpP2蛋白的最佳诱导温度,通过亲和层析Ni-IDA树脂纯化,获得高纯度的OmpP2蛋白,Western blot确定纯化的OmpP2蛋白与不同血清型的Hps阳性血清均存在良好的反应原性.本研究为进一步探索Hps OmpP2的生物学特性及对副猪嗜血杆菌病的血清学诊断、亚单位疫苗的开发奠定了基础.

关键词： 副猪嗜血杆菌 流行病学 ompP2基因 表达 纯化

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山东省副猪嗜血杆菌分子流行病学调查及其外膜蛋白P2基因的表达纯化

杨杰; 李建达; 曾昊; 任素芳; 郭立辉; 孙文博; 陈智; 丛晓燕; 于江; 吴家强; 《中国动物传染病学报 》 2018 北大核心

摘要：根据副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)外膜蛋白(outer membrane proteins,Omp)P2基因序列(GenBank登录号:FJ685754.1)设计引物,对2015～2016年在山东省不同地区采集的225份病料进行PCR扩增和遗传演化分析,结果发现2015年和2016年Hps检出阳性率分别为7.63%、7.48%,细菌分离确定225份样品中17份为阳性;Hps菌株之间的氨基酸同源性在86.7%～99.7%,同源性较高的蛋白具有交叉反应性。构建Hps omp P2基因原核表达载体,确定OmpP2蛋白的最佳诱导温度,通过亲和层析Ni-IDA树脂纯化,获得高纯度的OmpP2蛋白,Western blot确定纯化的OmpP2蛋白与不同血清型的Hps阳性血清均存在良好的反应原性。本研究为进一步探索Hps OmpP2的生物学特性及对副猪嗜血杆菌病的血清学诊断、亚单位疫苗的开发奠定了基础。

关键词： 副猪嗜血杆菌 流行病学 ompP2基因 表达 纯化

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副猪嗜血杆菌ompP2基因在猪肺泡巨噬细胞中的表达

于江; 杜以军; 李俊; 丛晓燕; 孙文博; 时建立; 陈智; 陈蕾; 吴家强; 王金宝; 《动物医学进展 》 2016 北大核心 CSCD

摘要：为了进一步研究副猪嗜血杆菌(HPS)ompP2基因的功能,根据已发表的副猪嗜血杆菌核苷酸序列,设计并合成1对引物,PCR扩增HPS LZ株外膜蛋白ompP2基因,获得大小为1 158bp的核苷酸片段,该片段纯化后克隆至pEASY-Blunt载体,转化后鉴定,再与真核表达质粒pCI-neo经过酶切和连接反应,转化感受态大肠杆菌Trans-T1,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。通过脂质体法将pCI-neoompP2转染猪肺泡巨噬细胞,通过RT-PCR和Western blot方法检测重组质粒是否表达。结果显示,成功构建了含ompP2基因的副猪嗜血杆菌真核表达载体pCI-neo-ompP2,提取转染该质粒的猪肺泡巨噬细胞的mRNA,进行RT-PCR扩增,在1 000bp~2 000bp之间可见1条明显的条带。Western blot发现在42ku处出现目的条带。试验结果为后期研究副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的机理奠定了基础。

关键词： 副猪嗜血杆菌 ompP2基因 真核表达载体 猪肺泡巨噬细胞 表达

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副猪嗜血杆菌的分离与血清型鉴定

于江; 吴家强; 张玉玉; 陶海英; 王金宝; 《家畜生态学报 》 2014

摘要：为了解副猪嗜血杆菌的血清型流行情况,采用细菌分离培养结合PCR的方法,对2008年至2012年,从山东、河南、河北、湖南、江苏、上海的多个猪场送检的186份疑似样品进行副猪嗜血杆菌的检测,再通过琼脂扩散试验对分离菌株进行了血清型鉴定。结果表明,从186份疑似样品中最终分离鉴定到57株副猪嗜血杆菌,分离率为30.6%。结果提示,我国副猪嗜血杆菌病存在不同程度的感染,以血清4型和5型最为流行,其次是血清1、12、13型,且该病的发生与季节和猪的日龄有关。

关键词： 副猪嗜血杆菌 分离鉴定 血清学 调查

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仔猪多发性关节炎病原菌的分离鉴定及耐药性研究

张玉玉; 吴家强; 任素芳; 郭立辉; 王大鹏; 尹斐斐; 范凤玉; 李俊; 周顺; 王金宝; 《西南农业学报 》 2012 北大核心 CSCD

摘要：从山东地区32个猪场发生多发性关节炎的仔猪体内分离到15株病原菌。通过对分离菌株的形态染色、分离培养、生化试验及种特异性基因的PCR扩增等方法鉴定菌株,结果显示4株分离菌株为副猪嗜血杆菌,7株为猪链球菌,2株为化脓隐秘杆菌,1株为猪胸膜肺炎放线杆菌,1株为猪丹毒杆菌。15株分离菌均对昆明小鼠有较强的致病力,且对先锋霉素类抗生素高度敏感,大多数菌株还对青霉素类、头孢菌素Ⅲ类、氟喹诺酮类、万古霉素、壮观霉素等抗生素高度敏感。该试验表明山东地区猪场仔猪多发性关节炎的病原菌主要是副猪嗜血杆菌和猪链球菌,可交替使用上述敏感抗生素防治该病。

关键词： 多发性关节炎 副猪嗜血杆菌 猪链球菌 药敏试验

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副猪嗜血杆菌血清5型分离株生长曲线与致病力研究

王大鹏; 吴家强; 于江; 丛晓燕; 杜以军; 孙文博; 张玉玉; 时建立; 李俊; 周顺; 王金宝; 《西南农业学报 》 2011 北大核心 CSCD

摘要：本文对副猪嗜血杆菌血清5型生长曲线进行了研究。结果表明:种子液接种后6 h开始进入对数生长期,培养24 h后活菌数达到最高峰,20～30 h活菌数维持在同一个水平,进入稳定期,30 h后活菌数呈现下降趋势,进入衰退期。该曲线提供了副猪嗜血杆菌生长规律,为疫苗研制提供了理论基础。

关键词： 副猪嗜血杆菌 血清5型 生长曲线 致病力

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副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术的建立与应用

于江; 吴家强; 张玉玉; 王兆; 李俊; 丁鹏; 李坤; 刘洋; 张金强; 徐绍建; 刘少宁; 周顺; 王文志; 王金宝; 《家畜生态学报 》 2010

摘要：根据GenBank中的副猪嗜血杆菌(HPS)的infB基因的序列(DQ781808.1),利用分子生物学软件Premier 5.0设计一对特异性引物,建立基于SYBR Green I荧光定量PCR检测HPS的技术。试验采用煮沸法从HPS培养物中提取DNA,进行PCR扩增。将鉴定正确的目的基因片段克隆入pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5α,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为阳性标准品。结果表明,该方法对HPS具有良好的特异性,不与其它猪源细菌发生交叉反应,其敏感性比常规PCR高100倍,而且非常稳定,批间与批内重复试验变异系数均小于2.5%。临床应用表明本方法的建立实现了对HPS的快速诊断和定量的检测。

关键词： 副猪嗜血杆菌 infB基因 SYBR Green I 荧光定量PCR

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传染性副猪嗜血杆菌病的危害与防治

成建国; 《农业知识 》 2004

关键词： 危害与防治 副猪嗜血杆菌

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