科研产出
牛气管抗菌肽的原核表达、体外抗菌活性及其组织分布分析
《畜牧兽医学报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：本文旨在对牛气管抗菌肽(tracheal antimicrobial peptide,TAP)基因进行原核表达,以及研究重组蛋白的抗菌活性,并分析TAP在各组织的表达分布情况,为开展转TAP基因抗乳腺炎奶牛研究提供技术资料。作者采用RT-PCR从荷斯坦奶牛气管扩增TAP基因,分析其序列后根据大肠杆菌表达系统对密码子的偏好性,人工合成牛TAP基因,构建pET32a(+)-TAP重组质粒;然后转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并纯化。对表达蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot鉴定;在线软件分析目的蛋白表达量。采用滤纸片法测定重组牛TAP的体外抗菌活性,并用RT-PCR法分析牛各组织中TAP表达情况。测序结果表明,扩增到114bp目的基因片段,可编码含38个氨基酸残基的成熟蛋白。SDS-PAGE分析表达的融合蛋白相对分子质量为24ku,重组蛋白以可溶性方式存在,表达量占菌体总蛋白的52.1%。Western Blot检测只出现单一条带。抗菌效价分析表明0.115μg·μL-1重组蛋白对牛源金黄色葡萄球菌有一定的抗菌活性。TAP基因在奶牛咽喉、肺、气管、小肠、肝、心脏及口腔黏膜中均有表达,在鼻黏膜和舌黏膜中微量表达,在皮肤中几乎不表达。作者成功表达了牛TAP基因,重组牛TAP蛋白在大肠杆菌中实现高效表达,并具有一定的抗奶牛乳腺炎致病菌的活性,为未来培育抗乳腺炎转基因奶牛及相关基因工程产品的开发奠定了基础。
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荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因克隆、原核表达及其抗菌活性分析
《中国农业科学 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：【目的】实现荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组BNBD12的抗菌活性。【方法】RT-PCR扩增荷斯坦牛中性粒细胞BNBD12基因,序列分析后人工合成了适于在大肠杆菌中表达的BNBD12成熟肽,构建原核表达载体pET32a(+)/BNBD12,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过琼脂扩散法分别确定重组蛋白对牛源乳腺炎主要致病菌革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌效果,应用扫描电镜观察重组蛋白的杀菌效应。【结果】测序结果表明扩增片段长度为180bp,可编码含60个氨基酸的成熟蛋白。SDS-PAGE和Western blotting分析显示人工合成的BNBD12的成熟肽基因以融合蛋白形式表达,表达量占菌体总蛋白的21.4%;纯化的重组蛋白0.05mg·mL-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显抑菌效果;扫描电镜观察发现重组蛋白作用后可引起病原菌内容物外泄而死亡。【结论】成功表达了荷斯坦牛中性粒细胞β-防御素12,该重组蛋白既可作用于革兰氏阳性菌又可作用于革兰氏阴性菌,显示出较好的临床应用前景。
关键词： β-防御素12(BNBD12) 荷斯坦牛 表达 抗菌活性 乳腺炎
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金黄色葡萄球菌聚集因子A(Clfa A)功能区基因的克隆及真核表达质粒构建
《家畜生态学报 》 2010
摘要：粘附素蛋白是金黄色葡萄球菌感染早期最重要的致病因子,研究根据金黄色葡萄球菌聚集因子A(clfa A)基因,设计合成特异性引物,以国内奶牛乳腺炎临床分离株金黄色葡萄球菌基因组为PCR模板,进行clfa A基因的克隆,并连接入pMD18-T载体进行测序和序列分析,然后经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后构建真核表达载体并进行鉴定。结果表明,以金黄色葡萄球菌标准株为对照,国内分离株多数在990 bp处扩增到特异性条带,经测序鉴定,与Genebank发表的金黄色葡萄球菌clfa A序列同源性为99%;构建的真核表达质粒通过PCR和双酶切鉴定证明构建成功,为研究核酸疫苗奠定基础。
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荷斯坦牛Nramp1基因遗传多态性及其与乳房炎相关性的研究
《遗传 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：利用PCR-SSCP技术检测了344头中国荷斯坦牛Nramp1基因exon 11的基因多态性,并分析了其不同基因型与乳房炎及产奶量性状的关系。结果表明:实验群体发现3种基因型AA、AB、BB,其中A等位基因为优势等位基因,等位基因频率为0.767,而B等位基因频率则为0.233。经X~2适合性检验,群体处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。测序结果显示:扩增片段分别在200 bp(C/G)和254 bp(T/G)存在碱基突变,并导致了氨基酸改变,分别为丙氨酸替换为脯氨酸(A1a356Pro)、亮氨基酸替换为蛋氨酸(Leu374Met)。通过构建最小二乘线性模型,进行Nramp1基因多态性与产奶量、体细胞评分(SCS)的相关性分析表明,AA型个体的SCS最小二乘均值显著低于BB、AB型(P<0.05),而AA型、AB个体的产奶量最小二乘均值显著高于BB型(P<0.01,P<0.05),AA基因型可作为乳房炎抗性的优良基因型。因此,可将Nramp1作为奶牛乳房炎候选基因应用于分子标记辅助选择育种。
关键词： Nramp1 遗传多态性 PCR-SSCP 乳房炎 中国荷斯坦牛
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奶牛乳铁蛋白基因5′侧翼区遗传多态性及其与乳腺炎关联性分析
《遗传 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：牛乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是保护乳腺组织的防御因子之一,是具有多种功能的糖蛋白。关于牛LF基因的多态性研究的报道较多,但其多态性与奶牛乳腺炎相关性的研究较少。文章采用PCR-RFLP、CRS-PCR对268头中国荷斯坦牛LF基因启动子区的-926(G/A)、-915(T/G)、-478(/G)、+72(T/C)突变进行基因型分型,应用最小二乘线性模型分析LF基因多态性与体细胞评分(Somaticcellscore,SCS)的相关性。结果表明,新发现+72(T/C)和-478(/G)对SCS有显著影响,而其他两个位点对SCS影响不显著(P>0.05)。+72(T/C)的AB基因型是优良基因型,其个体的SCS值均显著低于AA型(P<0.01)、BB型个体(P<0.05)。-478(/G)位点的C等位基因是优良的等位基因,CC基因型个体的SCS值极显著低于CD、DD基因型个体(P<0.01)。因此,LF基因+72(T/C)的AB基因型和-478(/G)位点的CC基因型均是奶牛乳腺炎抗性的优良基因型,可作为分子标记应用于奶牛乳腺炎抗性筛选。
关键词： 乳铁蛋白基因5′侧翼区 遗传多态性 乳腺炎 体细胞评分 中国荷斯坦牛
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奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白配基结合区基因的克隆与原核表达
《中国兽医学报 》 2008 北大核心 CSCD
摘要：运用PCR方法扩增出奶牛乳腺炎分离株10A的Fnbp配基结合区基因,该片段大小为350bp左右,将其与PGEM-T载体连接,转化到受体菌DH5α中,用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板筛选出含有重组子的菌株,鉴定成功后,测序结果表明:奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌10A的Fnbp配基结合区基因的序列与金黄色葡萄球菌Mu50、N315、MSSA476、MW2、RF122、COL以及NCTC8325的相应区域序列同源性分别为97%、97%、95%、95%、96%、94%和94%。将重组克隆载体质粒进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切回收后的DNA,定向插入到融合表达载体PET-32a中,构建了重组质粒PET-Fnbp,并转化到宿主菌BL21(DE3)株中,经IPTG4h诱导后,SDS-PAGE电泳表明,重组蛋白得到高效表达,重组蛋白主要以分泌形式存在,分子量35000左右,Ni柱纯化后的蛋白经Western-blotting检测,具有良好的抗原性和特异性。
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检测奶牛乳房炎主要病原菌的多重PCR方法的建立与应用
《中国兽医学报 》 2008 北大核心 CSCD
摘要：本试验针对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌3种主要的乳房炎病原菌设计了3对特异性引物,建立了多重PCR检测方法。结果表明,本方法的特异性为100%,最低检测浓度为1.25×103cfu/mL,充分表明该方法具有快速,准确和特异的优点。
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中国荷斯坦牛GlyCAM1基因遗传多态性与乳房炎关联性分析
《中国农业科技导报 》 2008
摘要：以273头中国荷斯坦牛为研究对象,利用CRS-PCR、PCR-SSCP及DNA测序技术检测糖基化依赖细胞粘附分子1(GlyCAM1)基因外显子3、内含子3的遗传多态性。结果表明:GlyCAM1基因分别在外显子3和内含子3的第2081(A/C)、2417(C/T)位存在突变,两位点在牛群中的等位基因频率A/B分别为0.752 5/0.2475,0.904 6/0.095 4;经χ2适合性检验,中国荷斯坦牛群2417位点的突变达到Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),但2081位点的突变未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)。采用最小二乘法拟合线性模型将该基因座不同基因型与奶牛乳房炎进行了关联分析,结果表明:胎次效应(P<0.01)、场效应(P<0.01)和泌乳月(P<0.05)对乳房炎的影响较大。2081位基因型效应对SCS的影响达到了显著水平(P<0.05),且AA基因型个体的SCS显著低于AB和BB基因型个体(P<0.05)。
关键词： 中国荷斯坦牛 糖基化依赖细胞粘附分子1基因 遗传多态性 SCS 乳房炎
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奶牛乳腺炎病原学比较研究
《家畜生态学报 》 2008
摘要：针对大型奶牛场和部分散养户的奶牛,对乳腺炎阳性和阴性乳汁进行细菌分离培养计数和生化鉴定,对分离到的病原菌做药物敏感性试验。试验中分离出的细菌主要是葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、棒状杆菌和酵母菌。经过生化鉴定,乳腺炎阳性乳分离得到的细菌大多数是明显溶血的,凝固酶反应呈阳性的强致病菌,细菌计数也高于乳腺炎阴性组,差异极显著;而乳腺炎阴性乳中所分离得到的细菌大多是环境中条件性致病菌,致病性不强。
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