科研产出
甜瓜蔗糖磷酸合成酶基因全克隆及工程载体的构建
《果树学报 》 2008 北大核心 CSCD
摘要：蔗糖磷酸合成酶在甜瓜果实蔗糖合成途径中起关键性的调节作用,克隆该基因并导入甜瓜低糖自交系,可改良甜瓜果实品质创新优良种质。从甜瓜幼苗叶片提取总RNA,利用RT-PCR与Southern blot方法相结合,重组子质粒经限制性内切酶酶切和PCR验证以及测序同源性比较,克隆到基因的5’(2859bp)和3’(852bp)。应用高保真Taq聚合酶PCR拼接蔗糖磷酸合成酶完整cDNA序列3692bp,该片段与GenBank中其它植物基因序列具有97%￣99%的同源性,登录号DQ364058。应用BamHⅠ、KpnⅠ、BglⅡ限制性酶切获得植物双元表达载体pROK2及基因的线性片段,通过T4连接酶反应,构建了以CaMV35S为启动子,以Tnos为终止子的工程载体pROK-SPS,该载体含有Npt-II选择标记基因。
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两株高致病性PRRSV ORF6和ORF7基因克隆及序列分析
《中国畜牧兽医 》 2008 北大核心
摘要：应用RT-PCR方法从实验室分离的两株高致病性PRRSV SX、ZQ株中扩增出ORF6和ORF7,将其分别克隆、测序。用DNAStar软件分析所测序列,并与VR-2332株、LV株、周边国家及国内分离株进行核苷酸和推导氨基酸同源性比较,并绘制系统进化树,结果ORF6、ORF7核苷酸与北美洲型的同源性为91.1%~100%,与欧洲型的同源性为66.2%~70.7%,推导氨基酸与北美洲型的同源性为91.2%~100%,与欧洲型的同源性为62.3%~82.3%。证明新分离到的PRRSV SX株、ZQ株仍属北美洲型。SX株ORF6、ORF7核苷酸与国内新分离到的高致病性PRRSV JXA1株同源性分别为99.8%、100%;ZQ株ORF6、ORF7核苷酸与国内新分离到的高致病性PRRSV JXA1株同源性分别为99.6%、99.7%。
关键词： 高致病性PRRSV ORF6 ORF7 克隆 序列分析
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梨α-法尼烯合成酶基因的克隆及其序列分析
《生物技术通报 》 2007 CSCD
摘要：利用RT-PCR技术从鸭梨的果皮中获得了一个全长为1824bp的α-法尼烯合成酶基因(α-Farnesene Synthase,PFS)克隆,该cDNA包含一个由1728个核苷酸组成的开放阅读框架,编码分子量约66kDa的576个氨基酸残基的蛋白质。序列相似性分析结果表明,它与苹果中克隆到的AFS1基因具有很高的同源性,核苷酸序列一致性为97.34%,且具有典型的萜类合成酶基因保守结构域。与来源于黄瓜、杉树、松树的α-法尼烯合成酶基因的同源性较低。
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重组鲁西黄牛α干扰素融合蛋白的表达及其抗病毒活性研究
《生物工程学报 》 2007 北大核心 CSCD
摘要：通过PCR从鲁西黄牛(Yellowcattle)基因组DNA中克隆了α干扰素(BoIFN-α)基因,并插入到pET32a+中,构建成重组原核表达质粒pET32a+/BoIFN-α,进行测序和诱导表达。测序结果表明,鲁西黄牛IFN-α基因全长498个核苷酸,含一个开放阅读框(ORF),编码166个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的牛α干扰素C亚型氨基酸组成同源性为97.6%。表达产物经SDS-PAGE分析,表达出40kD的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26.7%。表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化,纯化产物进行复性后在MDBK/VSV上的活性为5×105u/mg。重组牛IFN-α(rBoIFN-α)对牛轮状病毒(BRV)有一定的抑制作用,抗BRV病毒活性为1.5×105u/mg。结果显示从鲁西黄牛中克隆了IFN-α基因的一种新亚型,即BoIFN-αC2,并实现了高效表达,获得了具有较高抗病毒活性的重组干扰素产物,为重组牛干扰素的开发奠定了基础。
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鹅细小病毒QY分离株NS2基因的克隆及序列分析
《家禽科学 》 2007
摘要：参照GenBank中收录的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列设计并合成了扩增广东清远分离株(QY株)NS2基因的一对引物,利用PCR技术扩增出来长约1.5kb的目的片断,将其克隆到PMD18-T载体上,筛选重组质粒并进行了序列测定及分析,测序结果表明,GPV分离株NS2基因由1356个核苷酸组成,编码451个氨基酸。经与B株、DN株、FS株进行同源性比较,核苷酸的同源性分别为99.1%、99%和99%;推导的氨基酸同源性分别为98.7%、98.7%和987%。
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甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶基因cDNA片段的克隆及表达分析
《园艺学报 》 2007 北大核心 CSCD
摘要：根据在GenBank中登录的番茄、马铃薯等蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法从甜瓜花后25d的果实总RNA中扩增出目标cDNA片段,克隆到pMD18-T载体中。序列分析表明,该片段与番茄蔗糖磷酸合成酶氨基酸序列同源性为98.9%,GenBank中登记号为DQ355797。通过Northernblot检测其在甜瓜果实不同发育时期的表达变化,结果表明该基因在甜瓜果实花后25d开始表达,随着果实的成熟,表达量升高。
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鲁西黄牛α干扰素基因的克隆及表达
《动物学杂志 》 2007 北大核心 CSCD
摘要：提取黄牛血液基因组DNA,PCR扩增α干扰素基因,重组到pET32a+表达载体中。测序结果表明,扩增片段含有498bp的ORF,可编码166个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的牛α干扰素C亚型氨基酸组成同源性为97.6%。构建原核表达载体pET32a+/BoIFN-α,SDS-PAGE分析蛋白质表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为40ku,表达量占菌体总蛋白的26.7%。结果从鲁西黄牛中克隆了IFN-α基因的一种新亚型,即BoIFN-αC2,构建原核表达质粒,并实现了高效表达,为重组牛干扰素的开发奠定了基础。
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荷斯坦奶牛中性粒细胞β-防御素cDNA的克隆与序列分析
《动物学杂志 》 2007 北大核心 CSCD
摘要：为研发牛β-防御素生物制剂,防治奶牛乳腺炎。根据已发表的牛β-防御素基因序列设计一对引物。收集患乳腺炎奶牛乳静脉血液中性粒细胞,用试剂盒提取总RNA。经RT-PCR扩增牛β-防御素cDNA片段,回收纯化PCR产物,连接pMD18-T载体,转化感受态细胞JM109。在含X-Gal、Amp及IPTG的LB平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR及双酶切鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段碱基数为189bp,含有一个完整的ORF,能编码63个氨基酸的多肽,多肽中含6个保守半胱氨酸残基。用Blast程序进行检索比较,表明扩增序列与GenBank中发表的BNBD-7编码区序列96.3%相同。结果成功克隆出奶牛β-防御素家族的成员BNBD-7基因,为重组牛β-防御素的开发奠定了基础。
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