科研产出
PEPC基因在高油品种吉花4号及其亲本中的表达比较
《花生学报 》 2015
摘要：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是控制花生蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶。本研究利用荧光定量PCR(Quantitative Real-time RT-PCR)方法,检测了PEPC家族5个基因(AhPEPC1、AhPEPC2、AhPEPC3、AhPEPC4和AhPEPC5)在高油品种吉花4号及其两个亲本种子发育过程中的表达情况。结果显示,在种子发育的前期,吉花4号中AhPEPC1~4基因的表达量低于其父本唐油4号中AhPEPC1~4基因的表达量。AhPEPC5基因的表达量在吉花4号和唐油4号种子发育前期差异不大,但在果针入土后65d,唐油4号中AhPEPC5基因的表达量明显高于吉花4号。
全文链接
请求原文
花生中巨大芽孢杆菌对黄曲霉毒素合成相关基因的抑制
《浙江大学学报(农业与生命科学版) 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：分别在UF 715133-1和Jinhua 1012花生仁上接种黄曲霉和巨大芽孢杆菌,高压液相色谱法测定花生中黄曲霉毒素含量,借助生物芯片和实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR)测定巨大芽孢杆菌对黄曲霉毒素生物合成途径基因表达的影响,并用基因本体(gene ontology,GO)功能分类和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路方法对基因进行分类分析。在实验组Jinhua 1012和UF 715133-1中,黄曲霉毒素B1的含量降低了85%以上,一些编码蛋白质酶的基因显著下调,如短链脱氢酶、非核糖体多肽合成酶等。结果表明,从海洋中分离出的巨大芽孢杆菌可显著抑制黄曲霉毒素在花生上的合成,黄曲霉中多种基因的表达受到抑制,但这些基因在黄曲霉毒素生物合成中的作用并未阐明,其作用机制还有待进一步深入研究。
全文链接
请求原文
聚肌胞浓度和免疫刺激时间对猪外周血单核细胞基因表达的影响
《中国农业科学 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：【目的】聚肌胞(Poly I:C)是聚肌苷酸和聚胞苷酸的共聚物,能够模拟病毒感染后所形成的ds RNA,刺激机体产生抗病毒免疫反应和炎症反应。利用Poly I:C作为免疫刺激剂对猪外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)的免疫刺激试验中Poly I:C的最佳作用浓度和体外免疫刺激培养时间的研究还未见报道。本研究探讨不同的Poly I:C免疫剂量和免疫刺激时间对猪PBMC各细胞因子和受体基因表达的影响,确定Poly I:C进行免疫试验的最佳作用浓度和体外免疫刺激培养时间,为利用Poly I:C进行RNA病毒感染的免疫应答调控机理研究提供试验依据。【方法】以长白仔猪为研究对象,利用分离的PBMC和1﹕5稀释的EDTA-抗凝血,设置Poly I:C浓度梯度(0、10、20和40μg·m L-1)和不同的体外免疫刺激培养时间(4、8、12和24 h),通过荧光定量PCR方法测定Poly I:C免疫刺激下机体激活或者诱导表达的主要细胞因子(IL6,IL8,TNFα,IL10,IRF3,IFNα和IFNγ)和模式识别受体(TLR3和TLR4)的相对表达量,分析利用Poly I:C对猪全血和PBMC进行免疫刺激试验的最佳作用浓度和时间。【结果】猪PBMC中细胞因子和受体基因的表达量受Poly I:C浓度和免疫刺激时间的影响。各基因具有特征性的表达量变化曲线,达到最高表达变化倍数的浓度和体外培养时间各不相同。对于两个干扰素基因IFNα和IFNγ,最高表达量出现在Poly I:C免疫刺激培养4 h,而后随着培养时间的延长表达量逐渐降低,而其他5个细胞因子(IL6,IL8,TNFα,IL10和IRF3)和2个模式识别受体(TLR3和TLR4)基因随着Poly I:C浓度的增加和免疫刺激时间的延长变化倍数逐渐增加,在Poly I:C浓度为20-40μg·m L-1,免疫刺激时间为12-24 h达到最高表达量。但是,对于最高表达量出现在浓度20μg·m L-1和培养时间12 h的基因,其在浓度为40μg·m L-1和培养时间24 h表达变化量只有小幅下降。另外本研究还对比检测了1﹕5稀释血在Poly I:C免疫刺激下主要细胞因子和受体的表达变化,结果表明全血中各细胞因子和受体的整体表达变化倍数比PBMC低很多,特别是对于IL6和IL8这两个PBMC中表达变化很大的基因,全血中表达变化量不仅很小,而且变化趋势相反。相对于PBMC,稀释全血完整地保存了机体的原始状态,但是利用全血进行免疫试验的主要缺点是抗凝剂保留在全血中。研究中EDTAK2抗凝剂能与血液中的钙离子结合成为螯合物,从而阻止血液凝固,但是钙离子是细胞的重要信号分子,钙离子与EDTA的结合对后续的细胞功能可能产生一定的影响。另外,全血中的某些化合物与血浆蛋白的等成分可能参与免疫细胞对Poly I:C免疫刺激的调节,减少了对Poly I:C免疫刺激的应答。【结论】(1)综合分析所检测的细胞因子和受体的变化趋势,利用Poly I:C进行猪PBMC免疫刺激试验的最佳浓度和体外培养时间分别为20μg·m L-1和24 h。(2)1﹕5稀释的EDTA-抗凝血对Poly I:C免疫反应反应小,与PBMC对Poly I:C免疫应答有不同的应答反应趋势。
关键词： 猪 聚肌胞(Poly I:C) 外周血单核细胞(PBMC) 基因表达
全文链接
请求原文
水稻类受体蛋白激酶OsESG1的原核表达
《山东农业科学 》 2015
摘要：水稻类受体蛋白激酶Os ESG1在种胚中特异表达,属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Os ESG1基因全长c DNA经XhoⅠ、Bam HⅠ双酶切,与同样经双酶切的原核表达载体p ET-28a(+)经T4 DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌感受态细胞BL21。原核表达结果显示,Os ESG1可受1 mmol/L IPTG诱导表达,且蛋白表达量随诱导时间的延长而逐渐增加,诱导7 h后,蛋白表达至较高水平。对不同浓度IPTG诱导下的蛋白表达情况进行研究,结果显示,0.1 mmol/L IPTG对Os ESG1的诱导表达效果最好。
全文链接
请求原文
花生热激蛋白AhHSP70与热激因子AhHSF基因的克隆及表达分析
《山东农业科学 》 2015
摘要：热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)和热激转录因子(heat shock factors,HSFs)在植物热胁迫信号转导和耐热性的产生过程中发挥了重要作用。本研究从花生转录组文库中筛选到HSP70、HSF的c DNA片段,通过序列比对在花生全基因组序列中获得这两个基因的基因组序列,根据序列信息设计引物,以花生叶片c DNA为模板扩增全长ORF并进行生物信息学分析。结果显示,Ah HSP70基因的ORF全长为1 962 bp,编码653个氨基酸,分子质量为71.45 k D,理论等电点p I为4.93;Ah HSF基因的ORF全长为1 212 bp,编码403个氨基酸,分子质量为46.03 k D,理论等电点p I为4.85。Ah HSP70与Ah HSF均不具有信号肽,为可溶性蛋白,二级结构中有大量无规则卷曲。利用这两个基因的氨基酸序列分别与来源于其他物种HSP70、HSF的氨基酸序列进行同源比对,并构建进化树进行亲缘关系分析,结果表明,Ah HSP70与大豆Gm HSP70亲缘关系较近,与番茄Sl HSP70亲缘关系比较远;Ah HSF与菜豆Pa HSF亲缘关系较近,而与蒺藜苜蓿Mt HSF的亲缘关系较远。利用实时荧光定量PCR对Ah HSP70和Ah HSF在热胁迫情况下的表达进行分析,结果表明这两个基因在42℃高温条件下表达量显著升高,Ah HSP70在高温胁迫3 h后表达明显升高,热处理24 h和48 h后,表达量为对照的50倍和135倍;转录因子Ah HSF在高温胁迫3 h后表达明显升高,高温处理6 h后达到最高,随后下降。本研究初步验证了花生热激蛋白和热激因子基因在花生响应高温胁迫中的作用。
关键词： 花生 热激蛋白 热激因子 基因克隆 序列分析 基因表达
全文链接
请求原文
花生中一个NBS-LRR类基因的克隆和表达分析
《山东农业科学 》 2015
摘要：本研究利用同源克隆方法,根据已知植物抗病(R)基因保守结构域设计一对简并引物,采用RTPCR方法对花生抗旱品种J11进行扩增,获得了一个通读的NBS-LRR类基因片段,命名为PDR1。PDR1长度为474 bp,核苷酸比较分析表明,PDR1与已克隆的大豆抗性基因(XM006573278)相似性为75%,与豌豆(AF123699)、苜蓿(XM003604518)抗性基因的相似性为74%;生物信息学预测其全长CDS编码框为5 838bp,编码的蛋白质含1 945个氨基酸,含有NB-ARC等保守结构域。荧光定量PCR分析表明,PDR1基因在花生幼苗根、茎、叶中均有表达,相对表达量为叶>根>茎;干旱胁迫后PDR1的相对表达量在12 h达到顶峰,随后下降,趋于平稳。本研究从花生中成功获得了NBS-LRR类基因的同源序列,为筛选新的抗旱花生种质提供了理论依据。
关键词： 花生 NBS-LRR 同源序列 基因克隆 表达分析
全文链接
请求原文
花生光敏色素AhphyA和AhphyB基因的克隆及原核表达研究
《四川农业大学学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆了花生(Arachis hypogaea L.)的2个光敏色素基因,并对其进行生物信息学分析,构建这2个基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达蛋白,为进一步纯化蛋白制备抗体以及研究这2个基因在花生发育中的作用奠定基础。【方法】首先,根据花生转录组中编码光敏色素A基因与光敏色素B基因的部分序列,以花生叶片中提取的总RNA为模板,通过RT-PCR与RACE技术对这2个基因的全长ORF序列进行克隆;然后,使用MEGA软件分析花生光敏色素与其他物种中光敏色素的亲缘关系;构建AhphyA、AhphyB的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21并诱导蛋白表达。【结果】2个基因全长ORF分别为3378bp和3 456bp,分别编码1 125和1 151个氨基酸的蛋白;其氨基酸序列与大豆的光敏色素A蛋白和光敏色素B蛋白的相似性分别为88%和90%;经SDS-PAGE检测,在大肠杆菌中2个基因均能受IPTG诱导表达产生蛋白。【结论】利用RT-PCR与RACE技术从花生中克隆得到了2个光敏色素基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。
全文链接
请求原文
鸭甲肝病毒1型和3型间接ELISA方法的建立与应用
《微生物学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：【目的】研究鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)1型VP3和3型VP1串联基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测的间接ELISA方法。【方法】设计2对特异性引物,提取鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)的RNA,分别RT-PCR扩增得到714bp的DHAV-1VP3和720bp的DHAV-3 VP1基因,并克隆至p MD18-T载体中,然后依次将DHAV-1 VP3和DHAV-3 VP1定向插入p ET-32a(+)表达载体,获得重组表达载体p ET-1VP3-3VP1,进行IPTG(Isopropyl-beta-D-1-thiogalactopyranoside)诱导表达分析,以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并应用于临床。【结果】经IPTG诱导表达,在大肠杆菌中可稳定、高效地表达DHAV-1VP3-3VP1蛋白。Western blot检测结果表明,表达的重组蛋白与DHAV-1和DHAV-3阳性血清均能发生特异性反应。确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为1.0μg/孔,血清最佳稀释度为1∶200,临界值为OD6 50值≥0.38,建立的间接ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。该方法与中和试验分别检测DHAV-3阳性血清,两种方法的符合率各为96.3%和96.7%;初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测。【结论】以大肠杆菌表达的DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白建立的间接ELISA方法可用于DHAV-1和DHAV-3抗体的检测。
关键词： 鸭甲肝病毒1型 鸭甲肝病毒3型 VP1基因 VP3基因 表达
全文链接
请求原文
棉花GhSRO04/GhSRO08基因的克隆及表达分析
《分子植物育种 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：SRO转录因子在植物响应盐、旱和病菌等生物和非生物胁迫中具有重要的调节作用。本研究从抗枯萎病耐黄萎病的棉花品种鲁研棉32号中克隆获得2个基因:命名为GhSRO04和GhSRO08(Gen Bank登录号为KR534896和KR534895)。结果显示:GhSRO04包含一个最大开放阅读框1830 bp(ORF),推测编码609个氨基酸;GhSRO08包含一个最大开放阅读框1 842 bp(ORF),推测编码编码613个氨基酸。比对分析表明GhSRO04和GhSRO08基因均含有RCD1-SRO-TAF4结构域(RST)。系统进化树分析表明,GhSRO04和GhSRO08编码产物与拟南芥RCD1和SRO1亲缘关系最近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析基因表达显示,GhSRO04和GhSRO08基因均受黄萎病菌侵染、干旱和高盐诱导表达,表明GhSRO04和GhSRO08在棉花应对盐、旱和病菌胁迫中可能起着重要的调节作用,对棉花种质的抗逆性遗传改良具有潜在利用价值。本研究首次从棉花中分离鉴定出SRO类转录因子,并进行了初步功能分析,为棉花遗传改良储备了基因资源。
关键词： 棉花 GhSRO04/GhSRO08 SRO 基因表达 抗逆
全文链接
请求原文
马铃薯卷叶病毒CP基因水溶性原核表达的研究
《中国蔬菜 》 2015 北大核心
摘要：采用两种策略增强了马铃薯卷叶病毒(PLRV)CP基因的水溶性原核表达。首先,用5种可表达出分子伴侣的质粒分别转化重组菌TOP10(p BAD-LRCP),获得了既含p BAD-LRCP又含分子伴侣质粒的转化子;诱导转化子中PLRVCP基因与分子伴侣基因同时表达,SDS-PAGE结果表明,从转化子提取的水溶性蛋白中有明显的PLRV重组CP条带,即分子伴侣增进了重组CP的水溶性表达。其次,将PLRV-CP基因定向插入p ColdⅠ中构建了该基因的冷激诱导原核表达载体p Cold-LRCP,15℃、IPTG诱导24h,SDS-PAGE分析表明,从重组菌BL21(p Cold-LRCP)提取的上清蛋白中有明显的PLRV重组CP条带。试验结果表明,分子伴侣与冷激蛋白基因csp A的启动子均可提高PLRV-CP基因的水溶性表达,且后者的表达水平高于前者。
关键词： 马铃薯卷叶病毒 CP基因 分子伴侣 冷激蛋白启动子 原核表达 重组蛋白 水溶性
全文链接
请求原文
