科研产出
鸡传染性支气管炎病毒S1基因在毕赤酵母中的表达及其免疫学原性分析
《浙江农业学报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：根据对山东IBV流行株的遗传变异分析,选取流行代表株LC2,扩增其S1基因,将其S1基因克隆到pPIC9K载体中,构建了真核表达质粒pPIC9K-S1,经SacⅠ线性化后,通过电转化到毕赤酵母GS115中,经MD/MM及G418筛选,PCR鉴定,获得多拷贝阳性重组菌pPIC9K-S1-GS115。将重组菌在0.5%甲醇中进行诱导分泌表达,对表达产物进行SDS-PAGE,Western blot分析。结果显示,在酵母培养基上清中检测到分子量为90 ku为目的蛋白,与鸡IBV阳性血清发生特异性反应。将表达上清及其重组菌菌体饲喂SPF鸡,40 d后采血,可检测到IBV保护性抗体。结果表明:表达的IBV的S1蛋白具有很好的免疫原性,为ELISA诊断试剂盒的研制及IBV疫苗的研制奠定基础。
关键词： 鸡传染性支气管炎病毒 S1基因 毕赤酵母 表达 免疫原性
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微小毛霉凝乳酶基因的克隆及在毕赤酵母GS115中的表达
《山东农业科学 》 2009
摘要：以微小毛霉基因组为模板,PCR扩增得到凝乳酶结构基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,连接穿梭载体pPIC9K,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并测定其核苷酸序列。测序结果证实扩增得到的片段为凝乳酶基因,与GenBank报道的序列(No.X06219)存在6对碱基的区别。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,构建重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-m cp,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/m l、具有多拷贝基因的整合重组菌pPIC9K-m cp-03。用甲醇诱导进行初步发酵试验,测得该重组菌凝乳酶活力为5 660 U/m l,比微小毛霉发酵液提高50多倍,且发酵液电泳结果表明毕赤酵母自身分泌的蛋白很少,只能看到约38.5 ku的凝乳酶蛋白条带。
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重组凝乳酶摇瓶发酵条件的初步优化研究
《山东农业科学 》 2009
摘要：凝乳酶是一种酸性蛋白酶,用作动物饲料添加剂,可提高动物特别是幼龄动物对饲料中蛋白成分的消化吸收率,促进其生长。本试验研究了由毕赤酵母胞外表达多拷微小毛霉凝乳酶的摇瓶发酵条件。确定最佳表达条件为:甲醇每24 h添加1.0%,无氨基酵母氮源培养基(YNB)添加1.5%,采用pH6.0的磷酸缓冲液,诱导120 h,在此条件下,重组凝乳酶的产量可达6 500 IU/ml。
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鸡IFN-α基因的多点突变及其在毕赤酵母中的高效表达
《中国家禽 》 2008 北大核心
摘要：根据毕赤酵母基因的密码子选择偏爱性,在不改变其编码的氨基酸序列的前提下,对鸡IFN-α序列进行PCR介导的定点突变优化,将鸡IFN-α成熟肽序列中136～143位相近的4个Arg密码子和N端的6个稀有密码子突变为毕赤酵母高表达优越密码子,构建了含正确突变和未突变序列的克隆载体pMD-IFNm、pMD-IFN和酵母表达载体pPICZ-IFNm、pPICZ-IFN,电击转化毕赤酵母X-33菌株,经筛选、鉴定表明鸡IFN-α基因已整合到酵母基因组中。通过表达产物的抗病毒活性测定,筛选出突变与未突变高表达酵母转化子各1株。经密码子优化的突变重组酵母菌株PP-IFNm于BMMY培养基中诱导72h上清中抗病毒活性单位可达410U/mL,其活性比未优化重组酵母株PP-IFN(48.33U/mL)提高了约10倍。
关键词： 鸡IFN-α基因 多点突变 毕赤酵母 高效表达 抗病毒活性
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