科研产出
H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用
《病毒学报 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：H13亚型禽流感病毒以往只在海鸥、鸭等水禽中被发现,2018年,我们实验室报道了蛋鸡感染H13亚型禽流感病毒的证据,表明H13亚型禽流感病毒存在从水禽中溢出感染陆禽的风险,因而有必要加强对H13亚型禽流感病毒的监测。实时荧光定量PCR由于具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等优点,在病原监测工作中得到了广泛应用。本研究以H13亚型禽流感病毒的HA基因作为靶基因,设计了一对特异性荧光定量PCR检测引物,通过特异性试验、敏感性试验等,建立了H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法,并应用建立的检测方法对海鸥粪便样品进行核酸检测。实验结果发现,该检测方法的灵敏度为1.60×10~0拷贝/μL;该检测方法对H1、H3、H5、H6、H7和H9等6个亚型的禽流感病毒无交叉反应;该检测方法的敏感性是常规PCR的10倍;海鸥粪便样品中H13亚型禽流感病毒的核酸检测阳性率为18.8%。我们建立的H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强等特点,该检测方法可用于大量临床样品的快速检测,为H13亚型禽流感病毒监测工作的顺利开展提供了技术支撑。
关键词： H13亚型禽流感病毒 荧光定量PCR 检测 HA基因
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2016年~2018年山东地区25株H9N2亚型禽流感病毒分子分析
《中国预防兽医学报 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：H9N2亚型禽流感(AI)持续在我国鸡群中广泛流行,为了明确山东及周边养殖场H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的分子进化情况,本研究对2016年~2018年间从山东及周边养殖场病鸡中分离鉴定得到的25株H9N2亚型AIV分别纯化后进行全基因组测序和遗传演化分析,并分析序列中重要氨基酸位点的变异情况.全基因组序列分析显示:25株H9N2 AIV 8个基因节段均属于欧亚谱系,但8个基因节段的分子进化关系呈现出基因多样性:HA、NA基因来自Y280-like,25株分离株HA基因之间的同源性为92.8%~99.9%,NA基因之间的同源性为91.0%~99.9%;PB2基因来自G9-like;PB1、PA、NP、NS基因来自F98-like;M基因来自G1-like.HA蛋白的受体结合位点149、198、234和235位点变异最多,25株分离株HA均出现Q234L突变(相当于H3第226位氨基酸);21株分离株在HA蛋白218~300位糖基化位点缺失,所有分离株均在313~315位出现潜在的糖基化位点;仅3株分离株的NA蛋白在402位出现糖基化位点,而NA蛋白在264位有11株分离株出现了潜在糖基化位点;5株分离株在PB2蛋白的627位点发生变异,1株在PB2蛋白的714位点发生变异.以上结果表明,近3年山东周边地区流行的H9N2 AIV是由不同进化方式而来,部分重要氨基酸位点出现了变异,具有潜在感染哺乳动物的可能性,因此需加强H9N2 AIV的分离鉴定,密切监测其遗传变异情况.
关键词： H9N2亚型禽流感病毒 分子进化 糖基化 突变 HA基因
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山东地区10株H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因的遗传演化分析
《中国动物传染病学报 》 2018 北大核心
摘要：为了解2016年山东地区H9N2亚型禽流感病毒的变异情况,选取分离鉴定的10株H9N2亚型禽流感病毒分离毒株,分别对其HA和NA基因进行序列测定和分子特性分析,并应用Mega 5.0软件绘制相应的基因氨基酸进化树,进行遗传进化分析。结果表明:10株H9N2分离毒的HA裂解位点氨基酸均为RSSR/GLF,具有典型低致病性AIV HA基因的特征;其第226位氨基酸均为亮氨酸(L),因此具有结合人流感受体的分子特性。同时这10株病毒的NA基因颈部均有9个核苷酸的缺失,且NA的潜在糖基化位点均不超过8个。进化树分析表明,2016年山东地区H9N2流行毒株HA和NA基因均属A/Chicken/Beijing/1/1994亚群,并且同属于近几年在中国鸡群中流行的G57分支。
关键词： 禽流感病毒 H9N2亚型 HA基因 NA基因 遗传演化分析
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2016年～2017年山东地区商品肉鸡H9N2亚型禽流感病毒HA基因的分子特征和遗传进化分析
《中国预防兽医学报 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：为了解山东地区商品肉鸡H9N2亚型禽流感病毒(AIV)分离株的遗传变异情况,本研究对13株从不同肉鸡场分离的H9N2 AIV的HA基因进行PCR扩增、克隆和测序,并对获得的HA基因序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示:13个分离株的HA裂解位点均为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV的分子特征;8株分离株有8处糖基化位点,其余5株存在个别位点缺失情况;受体结合位点除198位有变异外,其它位点均保守;234位氨基酸均为L,因此具有与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特征。所有分离株HA基因核苷酸同源性为94.1%~99.8%,氨基酸同源性为94.3%~100%。HA基因进化树显示,所有分离株均属于欧亚分支中的A/Chicken/Beijing/1/1994(A/Duck/Hong Kong/Y280/97)亚群,也同属于近几年在中国鸡群中流行的以A/chicken/Zhejiang/HJ/2007为代表的G57分支。以上研究为H9N2亚型AIV的防控和疫苗研制提供了科学参考。
关键词： 禽流感病毒 H9N2亚型 HA基因 序列分析 遗传进化
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H9N2亚型禽流感荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
《黑龙江畜牧兽医 》 2017 北大核心
摘要：为了研究H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在家禽体内各个器官的分布,试验针对H9N2亚型AIV的HA基因设计1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin的引物,以阳性重组质粒作为标准品做标准曲线,建立荧光定量RT-PCR检测方法,并对人工感染H9N2的SPF雏鸡气管、胸腺、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠等器官进行3次重复检测。结果表明:该法线性关系R值均在0.99以上,检测极限均为10拷贝质粒DNA,比RT-PCR灵敏100倍以上;特异性好,批内和批间重复性试验变异系数均小于1%。通过比较各器官HA相对表达量,得出肠和胰腺中HA相对表达量最高,腺胃次之,脾脏、肝脏、胸腺、法氏囊中含量也比较高,气管、肺脏、肾脏中含量较低,其中肾脏含量最低。说明研究建立的H9N2亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR方法灵敏度高,特异性强。
关键词： H9N2亚型禽流感病毒 HA基因 RT-PCR 检测 病毒分布
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一株鸭源H_9亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA基因序列分析
《家禽科学 》 2017
摘要：本研究从发生产蛋下降疫情的山东某种鸭场采集病料,分离得到一株病毒。经血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验、测序分析,鉴定该毒株为H_9亚型禽流感病毒。对分离株HA基因进行测序及序列分析,结果显示该分离株HA基因的裂解位点为333PARSSR↓GLF339,符合低致病性AIV的特征;与参考毒株的HA基因组序列进行比较发现,核苷酸的同源性为93.7%~99.3%,推导的氨基酸的同源性为96.4%~98.6%,与Shandong/YT5/2010(H_9N_2)株同源性最高。
关键词： H_9亚型禽流感病毒 HA基因 序列分析
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近20年中国部分地区鸡源H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传演化及其变异频率
《微生物学报 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：【目的】通过比较不同时期的H9N2亚型禽流感流行毒株HA基因的分子特征和变异频率,揭示免疫压力下病毒的遗传演化趋势。【方法】选取源于课题组的40株鸡源H9N2毒株,以及从Gen Bank下载的136株中国鸡源H9N2流行毒株和7株经典毒株的序列,利用Lasergen 7.1和MEGA 5.1等软件,对其HA基因进行系统演化、分子特征和变异频率分析。【结果】系统发育分析表明,近20年的鸡源H9N2流行株分属于BJ94、Y280和S2等谱系,优势流行株的分布与年代密切相关。氨基酸序列比较显示,H9N2病毒不同谱系之间具有各自的特征,且存在着明显的氨基酸变异积累。以Ck/BJ/1/1994 HA基因为参照,1994–2014年间,H9N2流行株核苷酸和氨基酸的年均进化率分别为5.73×10~(–3)和4.25×10~(–3)。其中,2011–2014年的核苷酸(氨基酸)年均进化率为6.35×10~(–3)(5.32×10~(–3)),明显高于2006–2010年5.22×10~(–3)(3.70×10~(–3)),更显著高于疫苗推广初期1999–2005年的0.74×10~(–3)(0.50×10~(–3))。【结论】H9N2疫苗株和流行毒株的不匹配是病毒变异频率加快的重要原因。
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一株鹅源H9N2亚型流感病毒的分离鉴定及其HA基因的遗传进化分析
《山东农业科学 》 2016
摘要：2014年从山东省某鹅场发病鹅体内分离到一株具有血凝性的病毒,对其进行鉴定,并对其HA基因和NA基因进行克隆测序,分析了解其与其他H9N2各毒株间的变异关系和进化规律。结果表明:经HI交叉抑制试验和基因克隆最终证实该毒株为H9N2亚型流感病毒,将其命名为A/goose/Shandong/XJ/2014(H9N2),简称XJ。XJ分离毒株的HA基因裂解位点序列为PSRSSRGLF,为弱毒毒株的特征序列。其HA基因与其他参考株HA基因的核苷酸序列同源性为87.2%~99.9%,氨基酸序列同源性为87.4%~99.8%。XJ与国内大部分同期分离毒株遗传距离较近,尤其是2013年以后的分离毒株。
关键词： 禽流感 H9N2亚型流感病毒 HA基因 遗传进化
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1999～2013年山东H9N2亚型禽流感病毒HA基因的演化和HI抗原性差异分析
《中国科学:生命科学 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：利用生物信息学方法和血凝交叉抑制(HI)试验比较研究了山东地区低致病性禽流感H9N2亚型病毒的分子遗传变异和抗原性变化.对1999~2013年在山东地区分离并鉴定的35株H9N2病毒进行了HA基因测序和同源性分析,绘制了系统发育树.同源性比较显示,同一时期的毒株同源性较高,而不同年代的H9N2流行毒相差较大,如2010~2013年的H9N2流行毒之间核苷酸(氨基酸)同源性为94.5%~100%(96.1%~100%),但与疫苗株SD-6的核苷酸(氨基酸)同源性已降至90.0%~92.5%(91.8%~95.0%).系统发育树显示,35株H9N2病毒均属欧亚谱系,其中28株属于S2-like亚群,表明该类型毒株是山东地区最主要的流行株.重要氨基酸位点分析表明,2010年以后的H9N2流行毒,其HA蛋白裂解位点基序为PSRSSR↓GL,334位点均由原来的A变为S;与受体结合位点相关的234位点,则由Q变为L.选择不同亚群的H9N2代表毒株制备单因子血清,进行HI交叉抑制实验,结果发现,H9N2不同毒株之间均可发生一定的交叉反应,但相关指数最低已降至0.31,表明病毒已出现明显的抗原性变化.本研究证实,山东H9N2亚型禽流感病毒在分子和抗原水平上均已发生一定程度的变异.
关键词： H9N2 HA基因 系谱分群 HI交叉抑制 相关性
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1株产蛋高峰鸡H9N2的分离鉴定及HA基因序列分析
《西南农业学报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：从产蛋率下降的蛋鸡群中分离到1株具有血凝性的病毒,经HI交叉抑制试验证实为H9N2病毒,命名为A/Chicken/Shandong/JN/11,病毒对SPF鸡基本无致病性,IVPI为0。对其HA基因进行克隆测序,HA基因裂解位点的序列为RSSR↓GL,与弱毒基序一致;有7个潜在糖基化位点;受体结合位点除198位有变异外,其余均较保守;A/Chicken/Shandong/JN/11分离株分GenBank上发表的近几年来山东参考株HA基因的核苷酸之间的同源性为89.9%~97.4%,氨基酸序列之间的同源性为93.4%~97.5%。系统进化树分析表明,该毒株与近年来国内流行的A/Chicken/zhejiang/ZLB/11禽流感毒株类似。
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