科研产出
FMDV3D基因真核表达质粒的构建、表达及对Ⅰ型IFN信号通路的作用
《山东农业科学 》 2024 北大核心
摘要：本研究旨在构建口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)3D基因真核表达质粒,并探究其对Ⅰ型干扰素(interferon,IFN)信号通路的作用.根据GenBank序列合成 3D基因并将其插入真核表达载体pXJ41 构建真核表达质粒pXJ41-Myc-3D,经PCR、双酶切及测序鉴定正确后分别转染HEK-293T细胞和PK-15 细胞,Western blotting及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测 3D蛋白在细胞内的表达及定位.通过双荧光素酶报告基因(Luciferase)、Real-time PCR、TCID50 等试验检测HEK-293T细胞中过表达 3D蛋白对水疱性口炎病毒(Versicular stomatitis virus,VSV)诱导的Ⅰ型IFN信号通路的影响.结果显示,真核表达质粒pXJ41-Myc-3D构建成功;3D蛋白在HEK-293T细胞中表达,大小约为55 kDa,主要定位在细胞核中;3D蛋白抑制了VSV诱导的IFN-β启动子活性和IFN-β mRNA水平,促进了VSV的复制.本研究为深入探究 3D蛋白抑制Ⅰ型IFN信号通路的作用机制奠定了基础.
关键词： 口蹄疫病毒 3D蛋白 真核表达 Ⅰ型IFN信号通路
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针对非洲猪瘟病毒p30基因CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建和初步鉴定
《中国动物传染病学报 》 2023
摘要：构建针对非洲猪瘟病毒(ASFV)p30(CP204L)基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统,探究该系统对p30蛋白真核表达的影响.以含p30基因序列的质粒p30-IRES为模板,定向扩增目的基因片段并克隆至pmCherry-N1载体,构建含有p30、红色荧光报告基因的融合表达质粒;通过网站http://crispr.mit.edu/设计靶向CP204L的单导向RNA(sgRNA),并克隆至Cas9表达质粒eSpCas9-2A-GFP(PX458)中.将融合表达质粒与Cas9表达质粒共转染HEK 293T细胞,同时设置对照组,转染48 h后通过Western blot和荧光定量PCR(qPCR)方法分别检测转染细胞中p30蛋白和mRNA表达水平.由于CRISPR/Cas9基因编辑系统靶向切割p30基因,Western blot和qPCR结果显示转染靶向p30基因的Cas9质粒后,p30蛋白的真核表达受到抑制,具有显著性差异(P<0.05).结果表明,CRISPR/Cas9基因编辑系统可以高效切割非洲猪瘟p30基因,抑制该蛋白的真核表达水平,该体系为抑制病毒生长和疫情防控提供了新的研究思路.
关键词： 非洲猪瘟病毒 p30基因 CRISPR/Cas9 单导向RNA 真核表达
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猪Mx1基因及分段基因真核表达载体的构建和鉴定
《畜牧与兽医 》 2019 北大核心
摘要：试验旨在通过对猪Mx1基因及其分段基因的真核表达载体的构建和鉴定,为进一步研究Mx1基因的功能奠定基础。试验以猪Mx1的基因序列为基础,以真核表达质粒pXJ41为载体,依据Mx1的蛋白结构进行分段,添加了Flag标签,构建了Mx1及Mx1分段基因的真核表达质粒,分别命名为pXJ41-Flag-Mx1、pXJ41-Flag-G、pXJ41-Flag-GMD、pXJ41-Flag-MDL4、pXJ41-Flag-GED。然后通过免疫印迹试验检测上述质粒在HEK-293T细胞中的表达情况,通过间接免疫荧光试验鉴定目的蛋白在细胞内的定位情况。免疫印迹试验成功检测到了Mx1及Mx1分段基因的蛋白条带,间接免疫荧光试验检测到各目的蛋白定位于细胞质。上述真核表达质粒可在HEK-293T细胞中成功表达,Mx1及其分段真核表达质粒的构建和成功表达及定位对进一步探索Mx1的功能及机制奠定了基础。
关键词： Mx1基因 真核表达 抗病毒蛋白 蛋白分段 免疫印迹
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牛轮状病毒结构蛋白VP4基因的真核表达
《安徽农业科学 》 2012 北大核心
摘要：[目的]克隆获得牛轮状病毒VP4全基因,并进行真核表达。[方法]采用RT-PCR技术,从牛轮状病毒总RNA中扩增出VP4基因,将其重组到含有Flag标签的pcDNA3.1(+)载体中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,通过Lipofect2000TM转染293T细胞,细胞增殖后经RT-PCR和Western Blot检测VP4基因的表达。[结果]获得了VP4基因的阳性重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-VP4;转染293T细胞后经RT-PCR和Western Blot检测表明,该基因的重组表达载体构建正确,可在293T细胞内瞬时表达。[结论]VP4基因的重组真核表达载体构建成功并可在真核表达细胞内表达,该研究为VP4基因的DNA疫苗的研发及应用奠定了基础。
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具有绿色荧光标记的表达T7 RNA聚合酶稳定细胞系的建立
《安徽农业科学 》 2011 北大核心
摘要：[目的]建立具有绿色荧光标记表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞系。[方法]从BL21(DE3)大肠杆菌中克隆出T7RNAP基因,定向克隆质粒FG12后,构建了表达T7 RNA聚合酶基因(T7)的Lenti-virus重组质粒FG12-T7 RNAP。用此重组质粒转染293T细胞,WB可检测出瞬时表达的T7 RNAP蛋白;利用辅助质粒对表达T7的非复制型Lenti-virus病毒进行体外包装,所获得的非复制型Lenti-virus病毒感染BHK-21细胞,利用GFP通过流式细胞分选仪筛选表达T7的细胞系,并利用WB检测基因的表达。[结果]通过WB检测出不同代次的阳性细胞中均能稳定表达目的基因T7 RNA聚合酶。[结论]T7 RNA聚合酶能顺利在真核细胞内表达,并在此基础上建立的稳定细胞系为RNA病毒体内拯救技术平台的建立奠定了基础。
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具有绿色荧光标记的表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞系的建立(英文)
《Agricultural Science & Technology 》 2010
摘要：[目的]建立具有绿色荧光标记的表达T7RNA聚合酶的稳定细胞系。[方法]从BL21(DE3)大肠杆菌中克隆出T7RNAP基因,定向克隆进质粒FG12后,构建了表达T7RNA聚合酶基因(T7)的Lenti-virus重组质粒FG12-T7RNAP。用此重组质粒转染293T细胞,WB可检测出瞬时表达的T7RNAP蛋白;利用辅助质粒对表达T7的非复制型Lenti-virus病毒进行体外包装,所获得的非复制型Lenti-virus病毒感染BHK-21细胞,利用GFP通过流式细胞分选仪筛选表达T7的细胞系,并利用WB检测基因的表达。[结果]通过WB检测出不同代次的阳性细胞中均能稳定表达目的基因T7RNA聚合酶。[结论]T7RNA聚合酶能顺利在真核细胞内表达,并在此基础上建立的稳定细胞系为RNA病毒体内拯救技术平台的建立奠定了基础。
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鲁西黄牛IFN-α基因克隆及其真核表达质粒的构建
《动物医学进展 》 2006
摘要：为研发牛α干扰素制剂,根据已发表的牛α干扰素基因序列设计一对引物。提取黄牛血液中白细胞基因组DNA,PCR扩增出α干扰素基因,并克隆到pMD18-T载体。测序结果表明,扩增片段含有570bp核苷酸,编码189个氨基酸,与已报道的牛α干扰素亚型氨基酸序列同源性在93.1%~95.2%之间。该基因与真核表达载体pcDNA3.1+相连,构建真核表达质粒,为牛α干扰素的临床应用奠定了基础。
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