科研产出
副猪嗜血杆菌环介导等温扩增检测方法的建立及应用
《山东农业科学 》 2020
摘要：本试验针对副猪嗜血杆菌的16S rRNA基因设计环介导等温扩增(LAMP)引物,建立副猪嗜血杆菌LAMP方法,并进行特异性和灵敏度试验.结果显示,建立的LAMP检测方法特异性良好,与其它5种细菌无交叉反应,灵敏度为10-4 ng/μL.分别使用LAMP和PCR方法对30份临床采集样品进行检测,阳性检出率均为40%,符合率100%.本试验建立的LAMP检测方法不需要特殊的仪器设备,可用于副猪嗜血杆菌的鉴定.
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环介导等温扩增技术在畜禽病原微生物检测中的应用及进展
《山东农业科学 》 2020
摘要：畜禽食品安全一直是全世界公共健康的关注焦点.环介导等温扩增(LAMP)是在等温条件下对目标DNA序列进行扩增的一种技术,在微生物检测方面,与常规技术相比,具有方法简单、特异性强、便于观察结果、不需要精密仪器等优势.该文主要对LAMP在畜禽微生物检测上的应用及进展进行综述,并对其优缺点进行分析.
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甘薯羽状斑驳病毒RT-LAMP快速检测方法的建立
《中国农业科学 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：【目的】甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)侵染甘薯造成重要危害,本研究旨在利用反转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立一种快速、高效检测SPFMV的方法。【方法】从Gen Bank上获得SPFMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列,利用Primer Explorer V4设计4条RT-LAMP特异性引物SPFMV-FIP(5′-TAAGCGCGGCTGCC TTCATC-CATTCAACCACCCCTGCA-3′)、SPFMV-BIP(5′-TCGGTTGTTTGGTTTGGACGGA-ATCAGTTGTCGTGTGCCTC-3′)、SPFMV-F3(5′-GAGTCTTGCGCGATATGCA-3′)和SPFMV-B3(5′-ACCCCTCATTCCTAAGAGGT-3′),同时设计2条反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)的特异性引物SPFMV-F(5′-TCTAATGAGAACACTGAA TT-3′)和SPFMV-R(5′-TTGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′)。分别设置F3/B3﹕FIP/BIP引物浓度比(1﹕1、1﹕2、1﹕4、1﹕6、1﹕8和1﹕10),d NTPs浓度梯度(0.025、0.125、0.225、0.325、0.425、0.525、0.625、0.725和0.825mmol·L-1),Betaine浓度梯度(0.4、0.7、1.0、1.3和1.6 mol·L-1),反应温度(59、61、63、65、67和69℃)和反应时间(20、30、40、50、60、70、80和90 min),对RT-LAMP反应体系各条件进行优化,确定最佳反应体系。通过测序及酶切对RT-LAMP产物进行鉴定。以携带SPFMV、甘薯C病毒(Sweet potato virus C,SPVC)、甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)、甘薯病毒2(Sweet potato virus 2,SPV2)、甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯G病毒(Sweet potato virus G,SPVG)、甘薯褪绿斑病毒(Sweet potato chlorotic fleck virus,SPCFV)和健康甘薯叶片的总RNA为模板,分别进行RT-LAMP和RT-PCR特异性检测;带有SPFMV的甘薯总RNA进行10倍梯度稀释,以RNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀释液为模板进行RT-LAMP和RT-PCR灵敏度测定。最后利用优化的RT-LAMP体系对山东省多地采集的SPFMV疑似病样进行检测,加入SYBR green I进行可视化检测。【结果】建立了SPFMV的RT-LAMP快速特异性检测方法,优化的反应体系:引物SPFMV-FIP/SPFMV-BIP为0.8μmol·L-1,SPFMV-F3/SPFMV-B3为0.2μmol·L-1,d NTPs为0.325mmol·L-1,Betaine为1 mol·L-1;65℃反应70 min。特异性试验显示本研究建立的RT-LAMP只对携带SPFMV的RNA能够扩增出典型的梯状条带。RT-LAMP最低可检测的RNA浓度为121.6×10-4 ng·μL-1,而RT-PCR最低能检测的RNA浓度为121.6×10-3 ng·μL-1,表明RT-LAMP的灵敏度比RT-PCR高10倍。田间样品检测,RT-LAMP扩增结果与可视化检测结果一致,表明本研究建立的RT-LAMP快速检测方法可有效应用到SPFMV的田间检测。【结论】建立的RT-LAMP快速检测方法灵敏度高、特异性好,适用于SPFMV的田间快速检测。
关键词： 甘薯 甘薯羽状斑驳病毒 反转录环介导等温扩增技术 检测
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荧光显色技术在鸭坦布苏病毒LAMP检测方法中的应用及比较
《中国兽医科学 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：参考NCBI中已收录的鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因保守区域设计了6条引物,通过对反应体系中各组分和条件进行优化,建立了DTMUV环介导等温扩增(LAMP)检测体系,并应用荧光显色剂(SYBR GreenⅠ和钙黄绿素、锰离子)对扩增产物进行可视化判定。结果显示,以SYBR GreenⅠ为染料,显色敏感性为10copies/μL的病毒,比普通PCR高100倍;以钙黄绿素和锰离子组合作为显色剂,其显色极限为1 000copies/μL的病毒,虽低于SYBR GreenⅠ的显色敏感性,但能有效地避免气溶胶造成的空气环境污染。结果表明,本研究建立的荧光显色LAMP体系敏感性高、能避免交叉污染,具有在科研机构、基层实验室特别是检测现场推广和应用的潜力,能够为从源头遏制该病的发生和蔓延提供有效的手段。
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基于荧光显色的IBV LAMP检测方法研究
《西北农林科技大学学报(自然科学版) 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：【目的】建立基于荧光显色的可视化禽传染性支气管炎病毒(IBV)环介导等温扩增(LAMP)检测体系,为IBV的快速临床检测提供有力的技术支持。【方法】根据NCBI中收录的IBV 5a+5b基因的8个区域设计了3对LAMP引物,通过对反应体系各组分和条件的优化,建立IBV LAMP检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行验证。分别用SYBR Green I和一定浓度比的钙黄绿素/锰离子混合物作为显色剂,对IBV LAMP检测结果进行可视化判定。应用该检测体系和PCR方法对临床送检的60份样品同时进行检测,比较2种方法的阳性检出率。【结果】成功建立了IBV LAMP检测方法,该方法能够在等温(63℃)条件下1h内完成反应,具有良好的敏感性和特异性,最低可以检出1拷贝/μL的阳性重组质粒,比普通PCR方法敏感100倍,而对其他病毒检测结果均为阴性。应用SYBR Green I和钙黄绿素/锰离子显色时,阴阳性样品均有强烈的颜色对比,其中0.05mmol/L钙黄绿素与0.6mmol/L锰离子混合液可以用于LAMP扩增产物的判断,其结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。在对60份临床样本的检测中,LAMP和PCR方法检测出的阳性样本数量分别为49份和42份。【结论】建立了基于荧光显色的IBVLAMP检测方法,该方法具有在科研机构、基层实验室特别是检测现场推广和应用的潜力。
关键词： 传染性支气管炎病毒 环介导等温扩增 荧光显色 钙黄绿素
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