科研产出
棋盘试验优化噬菌体与大肠埃希菌的最佳感染复数
《中国抗生素杂志 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：目的利用棋盘法测定噬菌体与大肠埃希菌在不同浓度比条件下的杀菌作用,优化传统的最佳感染复数试验。方法先利用96孔培养板纵向10倍梯度稀释噬菌体,再利用新的96孔板横向10倍梯度稀释大肠埃希菌,最后用排枪分别从稀释好的噬菌体孔板和稀释好的菌液孔板中吸取100μL混合液转移到同一个新孔板中混合培养。用96点阵检测板沾取过夜培养的混合液分别接种于LB固体琼脂检测板与LB宿主菌半固体琼脂检测板上,37℃培养14h。结果受噬菌体密度和宿主菌的数量的限制,多重性感染(multiplicity of infection,MOI)基本上在109~1010PFU/m L范围内波动,这种差异并没有本质的区别。棋盘试验3种方法都一致显示大肠埃希菌浓度低于106CFU/m L,噬菌体效价高于104PFU/m L时,呈现稳定的杀菌效果;固体检测板结果显示在呈现稳定的杀菌效果的区域内外,也有不同生长程度的菌落;半固体检测板均出现噬菌斑,表明两者作用结束后都有噬菌体存留,并生长成为充分的噬菌斑,但MOI测定时效价在一个数量级内有差异。结论 MOI试验着眼于噬菌体裂解固定数量的宿主菌的能力,棋盘试验则是着眼于对宿主菌的裂解杀灭活性;利用96孔液体培养板棋盘法可以很好的确定噬菌体与大肠埃希菌作用有效范围和最低噬菌体使用浓度,可以为杀灭不同浓度宿主大肠埃希菌提供噬菌体效价参考。一般情况下细菌的浓度最高达到109~1010CFU/m L,考虑到实际细菌的感染量不会太高的情况,采用105PFU/m L噬菌体能起到可靠的杀菌作用。
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微量肉汤稀释法药敏试验的误差分析
《中国抗生素杂志 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：药敏试验是抗菌药理学的重要内容,也是临床施药的重要依据。在严格参照CLSI药敏试验标准的情况下,测定的最低抑菌浓度(MIC)结果依然波动。本文分析了微量肉汤稀释法存在的试验误差和差异,包括同一个菌落的重复试验、同一菌株的不同菌落测定值、同一只鸡肠道分离的不同菌株测定值、以及试验操作人员测定值、同一鸡舍不同鸡测定值。结果表明,前3项因素差异不显著,整体试验存在1~2个梯度的误差,主要是由于菌株群体MIC的离散性、倍比设置的抗生素梯度的离散性,以及肉眼观察浊度的主观误差造成。值得注意的是,同一鸡舍不同鸡个体差异可能较大,在条件允许的情况下,尽可能多采集几只鸡样品,以MIC频率分布表征菌群整体的抗药性水平。
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抑制E.coli的SOS应答对恩诺沙星抗药性的影响
《中国科学:生命科学 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：通过敲除SOS应答启动蛋白基因rec A,探讨SOS应答对E.coli恩诺沙星抗药性的影响,并体外评价Rec A抑制剂和恩诺沙星联用对细菌协同抑制作用的影响.利用Red重组系统,构建E.coli ATCC 25922的rec A缺失菌株E.coli ATCC 25922/?rec A;在恩诺沙星压力下,利用荧光定量PCR测定SOS应答系统相关基因rec A和umu C表达量的变化.用微量肉汤稀释法测定恩诺沙星等常用抗生素对两个菌株的MIC变化;利用梯度平板法测定恩诺沙星对两个菌株抗药性变异的影响;合成Rec A抑制剂,并评估其与恩诺沙星联合抑制E.coli生长及其抗药性的作用.结果表明,E.coli ATCC 25922/?rec A菌株对恩诺沙星的最低抑菌浓度值降低至原始菌株的1/8;经药物处理后,在梯度平板上,rec A缺失菌株较野生型不易产生抗药性;荧光定量PCR表明,rec A缺失菌株或在Rec A抑制剂作用下,SOS应答系统受到一定的抑制.敲除rec A,使菌株对恩诺沙星的抗药性和抗药率均明显降低;Rec A抑制剂在一定程度上能抑制SOS应答,起到协同抑菌作用.
关键词： E.coli SOS应答 recA 恩诺沙星 抗药性 RecA 抑制剂
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大肠埃希菌过表达lexA基因对恩诺沙星杀菌力和抗药性突变的影响
《中国抗生素杂志 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：目的构建过表达SOS阻遏蛋白编码基因lexA的大肠埃希菌菌株,研究SOS应答对恩诺沙星抗药性突变的影响,并建立SOS应答抑制剂筛选平台。方法构建lexA重组表达质粒pET-22b(+)-lexA,转化大肠埃希菌BL21(DE3)构建重组质粒菌株BL21-lexA,用IPTG诱导BL21-lexA过表达lexA,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定LexA蛋白,用荧光定量PCR测定SOS应答基因recA和umuC表达变化;然后用恩诺沙星梯度平板测定恩诺沙星对BL21-unmodified(空质粒菌株)和BL21-lexA的抑菌活性和抗药性突变率。结果重组质粒菌株BL21-lexA在IPTG诱导下过表达LexA,抑制recA和umuC表达,提高了大肠埃希菌对恩诺沙星的敏感性,降低了抗药性突变率。结论通过IPTG诱导BL21-lexA过表达LexA蛋白,能构建稳定的SOS应答抑制模型,用于筛选SOS抑制剂,提高恩诺沙星杀菌力和降低抗药性突变。
关键词： lexA SOS应答 大肠埃希菌 恩诺沙星 抗药性突变 质粒过表达
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用线性梯度平板准确测定药物敏感性和分离抗药性菌株
《中国科学:生命科学 》 2011 北大核心 CSCD
摘要：菌群在药物的最低抑菌浓度附近的动力学过程是抗生素药理学研究的核心问题.建立一种能确定精确的MIC且又能准确分离抗药性菌株的方法,是目前临床对药敏实验新的要求.根据Fick扩散定律制备了线性梯度平板:将15mL含适当浓度恩诺沙星的琼脂培养基在9cm培养皿中倾斜凝固,刚好覆盖整个平板底面,然后水平放置,再在其上层加入同样体积的无药琼脂培养基,凝固12h后,药物浓度达到扩散平衡而呈均匀连续线性梯度.通过实测验证药物浓度在平板表面呈线性梯度分布.将待检E.coli菌群均匀涂布在梯度平板上,培养12h后,随恩诺沙星浓度提高依次形成连续密集小菌落区和离散大菌落区,根据两区域的分界线可以确定菌群自然形成的真实的MIC,与常规药敏实验方法测定结果一致.大菌落重新涂布高梯度平板,分界线显著上升,并检测出抗药性基因突变,表明该方法很容易筛选出菌群中的抗药性菌株.梯度平板可以方便地呈现整个菌群在MIC附近的动力学过程和遗传生理变化,并预警该抗生素使用后可能出现的抗药性,从而指导临床抗菌药物的选择和使用.
关键词： 线性梯度平板 E.coli 恩诺沙星 MIC 抗性菌
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影响大肠埃希菌感受态细胞因素的探讨
《动物医学进展 》 2007
摘要：研究不同型号的菌株、不同转化溶液、感受态细胞的存放时间、转化时间及转化后的复苏时间等对质粒转化效率的影响。结果表明,转化溶液浓度和感受态细胞的存放时间对转化效率有明显的影响,而转化时间、冰浴时间和转化后的振荡培养复苏时间对转化效率的影响不明显。
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