科研产出
基于RNAi技术抗黑条矮缩病水稻新品系的培育
《山东农业科学 》 2018
摘要：水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)由介体灰飞虱以持久性不经卵方式传播.该病毒引起的水稻黑条矮缩病分布范围广、危害重.RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来发现的一种重要的植物抗病毒基因工程策略,已广泛应用于植物抗病毒研究中.本研究利用已构建的包含P10 CP基因部分片段反向重复序列和生物安全性更高的标记基因bar基因的RNAi双元表达载体pRBSDV-CP3-bar,采用农杆菌介导转化水稻愈伤组织获得抗黑条矮缩病和抗除草剂的转基因水稻植株,通过抗性筛选、PCR检测及分子杂交分析,获得2个抗RBSDV和Basta的稳定品系,并对其田间抗性及农艺性状表现进行了鉴定,为抗RBSDV水稻新品种(品系)的培育奠定了基础.
关键词： 水稻黑条矮缩病毒 RNA干扰 反向重复序列 农杆菌介导
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花生AhFAD2基因抑制表达的转基因后代分析
《生物工程学报 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：FAD2(Δ~(12) fatty acid desaturase,Δ~(12)FAD或FAD2)是催化油酸在脂肪酸碳链Δ~(12)位脱氢生成亚油酸的关键酶。在花生中,FAD2酶活性下降或失活可提高籽粒中油酸的相对含量,改善花生籽粒及制品的品质和氧化稳定性。通过将种子特异性表达Lectin启动子和Ca MV35S启动子驱动的倒位重复Ah FAD2基因RNAi干扰结构转入花生,获得了以丰花1号(FH1)和花育23(HY23)为受体、携带上述2种转化结构、稳定遗传的花生转基因纯合体株系,转基因花生主要农艺性状与非转基因对照基本一致。实时荧光定量分析发现,各转基因株系发育种子中Ah FAD2基因的转录水平普遍下调。气相色谱法进一步测定了部分转基因后代株系种子的脂肪酸含量及组成,籽粒中油酸含量分别平均提高了15.09%(HY23为受体)、36.40%(FH1为受体),相应地,亚油酸含量平均下降了16.19%、29.81%,油亚比平均增加了38.02%、98.10%。各转基因株系的油酸含量显著提高;且在以FH1为受体的转基因株系后代籽粒以及种子特异性启动子驱动的转化结构中,RNAi的抑制效果更明显。通过RNAi技术抑制花生FAD2基因的表达,可以有效提高花生籽粒油酸含量。该技术体系可以为花生品质育种提供借鉴。
关键词： 花生 Δ~(12)脂肪酸脱氢酶 RNA干扰 转基因 油酸与亚油酸比值
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基于RNAi技术抗黑条矮缩病水稻新品系的培育
《山东农业科学 》 2018
摘要：水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)由介体灰飞虱以持久性不经卵方式传播。该病毒引起的水稻黑条矮缩病分布范围广、危害重。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来发现的一种重要的植物抗病毒基因工程策略,已广泛应用于植物抗病毒研究中。本研究利用已构建的包含P10 CP基因部分片段反向重复序列和生物安全性更高的标记基因bar基因的RNAi双元表达载体pRBSDV-CP3-bar,采用农杆菌介导转化水稻愈伤组织获得抗黑条矮缩病和抗除草剂的转基因水稻植株,通过抗性筛选、PCR检测及分子杂交分析,获得2个抗RBSDV和Basta的稳定品系,并对其田间抗性及农艺性状表现进行了鉴定,为抗RBSDV水稻新品种(品系)的培育奠定了基础。
关键词： 水稻黑条矮缩病毒 RNA干扰 反向重复序列 农杆菌介导
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牛Mx1基因重组慢病毒载体的构建及沉默Mx1细胞的获得
《中国兽医学报 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：采用RT-PCR技术从牛肾细胞中扩增出Mx1基因,构建牛Mx1基因过表达重组载体;针对牛Mx1mRNA序列设计shRNA引物对,构建针对牛Mx1的RNAi载体。将牛Mx1的过表达载体和RNAi载体共转染293T细胞,利用Western blot方法检测牛Mx1蛋白的表达情况,筛选有效沉默牛Mx1的shRNA;将有效沉默Mx1的RNAi载体转染牛胎儿气管原代上皮细胞,经流式细胞分选,Western blot检测,获得沉默牛Mx1的稳定细胞系。结果表明,成功构建了牛Mx1过表达重组载体pcDNA3.1-Mx1和RNAi载体RNAi-Mx1A、RNAi-Mx1B、RNAi-Mx1C,筛选到RNAi-Mx1A沉默牛Mx1效果最好;经流式细胞分选和Western blot检测,获得有效沉默牛Mx1的牛胎儿气管原代上皮细胞,为进一步探讨牛Mx1抗病毒作用及机制的研究奠定试验基础。
关键词： 牛Mx1基因 胎儿原代气管上皮细胞 RNA干扰
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凋亡抑制蛋白基因dsRNA转基因烟草表达载体的构建
《天津农业科学 》 2013
摘要：为了利用RNA干扰技术防治烟粉虱,需要构建凋亡抑制蛋白(IAP)基因dsRNA转基因烟草表达载体。利用PCR技术扩增烟粉虱IAP基因,将其连接到pMD18-T载体中,用BglⅡ、XhoⅠ和BamHⅠ、SalⅠ分别酶切,将获得的片段分别反向、正向连接至pUC-RNAi载体,用PstⅠ酶切pUC-RNAi-IAP,回收酶切片段,将其连接到表达载体pCAMBIA-2300-35S中,并进行酶切验证。IAPdsRNA转基因烟草表达载体的成功构建为下一步转基因烟草防治烟粉虱的研究奠定基础。
关键词： 凋亡抑制蛋白 dsRNA 转基因烟草 RNA干扰 烟粉虱
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利用RNAi技术抑制马铃薯类受体激酶基因(StRLK)表达的研究
《华北农学报 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：植物类受体蛋白激酶(Receptor-like protein kinase,RLK)是蛋白激酶的一个亚家族,参与植物的信号转导,在植物生长发育、抗病等过程中起重要作用。在前期研究中自二倍体马铃薯高抗青枯病基因型ED13中获得了类受体蛋白激酶基因StRLK。利用StRLK基因的特异区段,以pUCCRNAi为中间克隆载体、pCHF1为植物表达载体,构建了该基因的RNA干扰载体pCHF1-StRLK。进一步以ED13的茎段为外植体,利用农杆菌介导法将pCHF1-StRLK导入ED13中,获得了5株再生植株。用CaMV35S启动子特异引物对5株再生植株进行PCR扩增,均得到大小约500 bp的特异性条带,初步证明pCHF1-StRLK成功转入ED13。以ED13为对照,利用StRLK基因的特异引物对这5株再生植株进行半定量RT-PCR分析,结果表明,该基因的表达在5个转基因植株中均受到了不同程度的抑制,说明导入的pCHF1-StRLK发挥了干扰活性,且干扰效果与基因的插入位点有关,为进一步研究StRLK基因的功能提供依据。
RNA干扰技术在农作物害虫防治中的应用
《山东农业科学 》 2012
摘要：RNA干扰(RNAi)技术作为基因沉默的工具,已被广泛应用于农作物害虫防治研究。准确选择靶基因、将dsRNA或siRNA导入昆虫体内、siRNA在昆虫体内的扩增和扩散是RNAi技术应用于农作物害虫防治的基础。应用RNAi技术能有效地保护农作物抵抗害虫危害,在农作物遗传改良进行精准抗虫方面具有重大的应用前景。
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