科研产出
非洲猪瘟病毒p22蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
《山东农业科学 》 2023
摘要：非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种高度传染性病毒性疾病,发病率和死亡率高达 100%,对我国的生猪养殖业造成了毁灭性打击.p22 蛋白为ASFV的结构蛋白,本研究构建了重组原核表达质粒pET-32a-p22,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞表达重组p22 蛋白并纯化,经Western blot鉴定证实重组p22 蛋白与ASFV阳性血清有良好的免疫反应性.利用重组p22 蛋白免疫Balb/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到 2 株能够稳定分泌p22 蛋白单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株 2D6 和 5E7.经抗体亚型鉴定两株抗体均为IgG1 型;经Western blot鉴定,两株抗体能够特异性识别过表达的p22 蛋白.综上,本研究成功表达并纯化了p22 重组蛋白,制备了p22 单克隆抗体,为进一步探讨p22 蛋白的结构功能及其在ASFV中的感染致病机制提供了基础条件.
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针对非洲猪瘟病毒p30基因CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建和初步鉴定
《中国动物传染病学报 》 2023
摘要：构建针对非洲猪瘟病毒(ASFV)p30(CP204L)基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统,探究该系统对p30蛋白真核表达的影响.以含p30基因序列的质粒p30-IRES为模板,定向扩增目的基因片段并克隆至pmCherry-N1载体,构建含有p30、红色荧光报告基因的融合表达质粒;通过网站http://crispr.mit.edu/设计靶向CP204L的单导向RNA(sgRNA),并克隆至Cas9表达质粒eSpCas9-2A-GFP(PX458)中.将融合表达质粒与Cas9表达质粒共转染HEK 293T细胞,同时设置对照组,转染48 h后通过Western blot和荧光定量PCR(qPCR)方法分别检测转染细胞中p30蛋白和mRNA表达水平.由于CRISPR/Cas9基因编辑系统靶向切割p30基因,Western blot和qPCR结果显示转染靶向p30基因的Cas9质粒后,p30蛋白的真核表达受到抑制,具有显著性差异(P<0.05).结果表明,CRISPR/Cas9基因编辑系统可以高效切割非洲猪瘟p30基因,抑制该蛋白的真核表达水平,该体系为抑制病毒生长和疫情防控提供了新的研究思路.
关键词： 非洲猪瘟病毒 p30基因 CRISPR/Cas9 单导向RNA 真核表达
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非洲猪瘟病毒A104R蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定
《中国兽医杂志 》 2022 北大核心
摘要：为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)重组蛋白A104R(rA104R)及研制抗rA104R的多克隆抗体,本研究通过ExPASy等在线生物信息学软件初步预测该蛋白的理化性质、信号肽、核定位信号等信息,继而合成ASFV的A104R基因,构建基于pET-28a(+)载体的原核表达系统.重组蛋白用Ni亲和层析纯化后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blotting和液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术鉴定.纯化的蛋白免疫6-8周龄BALB/c小鼠,制备抗rA104R的多克隆抗体,通过West-ern blotting 和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定其反应性和免疫原性.结果显示,原核表达载体构建成功;重组菌在37℃诱导8 h后表达量最高,在包涵体和上清中均有表达,表明其呈部分可溶性表达;纯化的重组蛋白大小约16 kDa,且反应性良好;LC-MS分析结果显示,该rA104R蛋白多个肽段均与目标蛋白的氨基酸序列相匹配,匹配率为59%;制备的鼠源抗rA104R多克隆抗体效价大于1∶2 048 000,具有良好的免疫原性.结果表明,本研究制备的rA104R及其多克隆抗体可进一步用于生物学功能研究,并可为疫苗及相关诊断试剂研制提供基础材料.
关键词： 非洲猪瘟病毒 原核表达 A104R重组蛋白 液相色谱-质谱
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非洲猪瘟病毒UBCv1的原核表达及多抗制备
《北京农学院学报 》 2021
摘要：【目的】为研究非洲猪瘟病毒（ASFV）泛素结合酶（UBCv1）的生物学功能及致病机制奠定基础。【方法】以p3XFLAG-CMV-7.1-I215L质粒为模板,利用PCR方法扩增非洲猪瘟病毒I215L基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a,构建pET-28a-I215L重组质粒,并将其转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。重组蛋白经His柱层析纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性。【结果】成功构建了重组质粒pET-28a-I215L,重组菌经IPTG诱导后能够可溶性表达重组蛋白,产物约28 kDa,与预测大小一致。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶7 290 000;Western blot结果显示抗体具有较好的特异性。【结论】成功表达纯化了ASFV的泛素结合酶并制备其多克隆抗体,为后期解析ASFV泛素结合酶的结构、功能及病毒相关致病机制提供了重要的生物材料。
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