科研产出
猪IL-10 SYBR Green I Real-time PCR检测方法的建立
《家畜生态学报 》 2014 北大核心
摘要：白介素-10(IL-10)是一种具有免疫抑制作用的多能细胞因子。能够引发猪免疫抑制效应的多种病毒在感染宿主时均伴随有明显的IL-10上调,其中就包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),然而并不是所有的PRRSV毒株都能上调IL-10。为了详细探讨PRRSV免疫抑制与IL-10上调之间的关系以及PRRSV感染上调IL-10的具体分子机制,本研究针对猪IL-10以及看家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建了各自含有IL-10、β-actin引物扩增序列的重组质粒为阳性标准品,建立了以2-△△Ct为基础的SYBR GreenⅠrealtime PCR检测方法。该方法线性关系良好;敏感性高,两种基因的检测下限均为1×101copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性良好,批内变异系数小于2%,批间变异系数小于3%;目的基因及内参基因的扩增效率较高,分别为92.7%、97.8%。综上所述,该方法可以用于猪IL-10mRNA水平的表达分析。
关键词： 猪 白介素-10 PRRSV 免疫抑制 Real-time PCR
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番茄抗性基因Ty-1的PCR快速检测
《山东农业科学 》 2014
摘要：利用国内外已发表的10对标记引物对抗番茄黄化曲叶病毒病纯合系"JZ-108"(Ty-1/Ty-1)、感病纯合系"1712"(ty-1/ty-1)及杂交F1代的Ty-1抗性基因进行PCR扩增筛选,筛选出一对特异性引物SSR47,在抗病纯合材料中产生750 bp的扩增片段,感病材料中产生640 bp的片段,抗病杂合材料中同时产生750 bp和640 bp的扩增片段,标记结果与田间鉴定完全一致,证明该标记能够区分抗病材料、感病材料及杂合抗病材料,是与抗番茄黄化曲叶病毒病基因Ty-1紧密连锁的共显性标记。利用该标记对"JZ-108×1712"F2代的48个单株进行检测,有8株为抗病纯合基因型,19株为感病纯合基因型,21株为抗病杂合基因型,其中抗病纯合株与抗病杂合株田间表现均为抗病。经反复验证,结果准确可靠,该标记可用于对番茄抗病基因Ty-1的快速筛选鉴定。
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转基因抗虫玉米的定量检测
《中国农学通报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：建立高效、快速、准确的抗虫转基因玉米MIR162转化体特异性实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法。采用SYBR Green I和Taqman探针2种定量方法对抗虫转基因玉米MIR162进行了检测研究。SYBR Green I法MIR162转化体特异性片段和内标基因zSSIIb的熔解曲线均表现为单一峰,扩增特异性强;二者的扩增效率均在90%~100%之间,标准曲线相关系数R2均大于0.998。2种定量方法的检测限(LOD)均为24个拷贝,定量限(LOQ)为48个拷贝,灵敏度较高。重复测试结果表明,SYBR Green I法的标准偏差(SD)变化范围为0.05~0.13,相对标准偏差(RSD)范围为0.17%~0.40%,Taqman探针法的SD变化范围为0.03~0.14,RSD范围为0.11%~0.44%,说明2种定量检测方法具有良好的重复性和精密度。对MIR162含量为3%、1%和0.5%的混合样品的定量结果为:3.13%、1.09%、0.53%(SYBR Green I法)和3.07%、1.02%、0.50%(Taqman探针法),RSD均小于10%,T检验分析表明2种定量方法定值结果差异不显著。本研究建立的2种实时荧光定量PCR均可有效对转基因玉米MIR162进行定量检测,可根据不同实际需求及实验室条件进行选择相应的检测方法。
关键词： 转基因抗虫玉米 SYBR Green I Taqman real-time PCR
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一起鸭甲肝病毒1型和3型混合感染的研究报道
《家禽科学 》 2014
摘要：自山东省某疑似鸭肝炎发病鸭肝脏中分离到两株病毒,命名为TA1和TA2,分离毒分别回归3日龄雏鸭,可复制出鸭肝炎的典型症状和病理变化。利用鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)特异性引物进行RT-PCR扩增,结果为阳性,经测序证实为DHAV-1和DHAV-3。分别扩增分离毒的VP1基因,经序列测定及遗传进化关系分析发现,分离毒TA1和DHAV-3毒株之间有较高的核苷酸序列相似性,与DHAV-3遗传距离最近,属于基因C型;分离毒TA2和DHAV-1毒株之间有较高的核苷酸序列相似性,与DHAV-1的遗传距离最近,属基因A型。
关键词： 鸭甲肝病毒1型 鸭甲肝病毒3型 分离 RT-PCR 混合感染
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槭树叶片类黄酮糖基转移酶基因RT-PCR扩增体系优化
《山东农业科学 》 2013
摘要：以槭树"秋天火焰"变色期秋季叶片为试材,采用改良CTAB法提取叶片总RNA,利用GenBank中相关物种的UFGT基因序列设计特异引物,进行RT-PCR扩增并对RT-PCR反应体系中的引物、退火温度和循环次数进行优化,建立了槭树叶片UFGT基因的RT-PCR扩增反应体系。
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榛子甜菜碱醛脱氢酶基因BADH的克隆及在越冬过程中的表达特性分析
《山东农业科学 》 2013
摘要：甜菜碱是高等植物体内一种重要的渗透调节物,甜菜碱醛脱氢酶(Betaine aldehyde dehydrogen-ase,BADH)是甜菜碱合成的关键酶之一,本文基于Solexa技术对平榛花芽转录组测序结果的分析采用RACE-PCR技术克隆到一个平榛BADH基因,命名为ChBADH(HQ700873).ChBADH cDNA全长1 691 bp,具有一个1 512 bp的潜在编码区,编码503个氨基酸,预测其蛋白质相对分子量54.7 ku,理论等电点为5.44.Ch-BADH具有BADH家族保守的VSLELGGKSP功能活性位点和特征多肽序列,序列比较和生物信息学分析结果显示ChBADH在保守结构域和其他植物来源的BADH享有高度的一致性.以ACTIN为内参,对ChBADH基因在四个时期平榛的表达模式进行了初步的研究,荧光定量结果表明,ChBADH在寒冬时期被强烈的诱导表达,是非冷适应时期的3.5倍,推测该基因可能与榛子花芽越冬有紧密关系.
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石榴F3’H基因PCR反应体系的研究
《湖北农业科学 》 2013 北大核心
摘要：从石榴(Punica granatum L.)泰山红品种的花瓣中提取总RNA并反转录得到cDNA。设计简并引物对石榴类黄酮3’-羟化酶(F3’H)基因进行PCR扩增,筛选合适的引物及退火温度。结果表明,适合石榴F3’H基因扩增的正反向引物分别为5′-CGTNGAYGTBGTBGTBGCSKCVTC-3′,5′-TCHCCDGCWATG-GCCCAHAYRTT-3′。PCR反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性40 s,54℃退火45 s,72℃延伸60 s,共35个循环;72℃保温10 min。
关键词： 石榴(Punica granatum L.) F3’H基因 PCR
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平榛脱水素基因的克隆与表达分析
《园艺学报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：以平榛(Corylus heterophylla Fisch.)花芽为试材,采用 RT-PCR 和 RACE 方法克隆了一个平榛与脱水素基因同源的 cDNA 基因,命名为 ChDHN(GenBank 登录号 HM228389),其全长 639 bp,具有一个 504 bp 的潜在编码区,编码 167 个氨基酸组成的多肽,具有 LEA 类家族成员具有的特征多肽序列,属于 Y4SK2类型 DHN 基因,预测 ChDHN 蛋白质分子量 18.03 kD,预测其理论等电点为 7.28。对ChDHN 的时空表达特性进行了研究,以 Actin 为内参,对 ChDHN 在 4 ℃冷激条件下(0、2、4、8、24和 48 h)的表达模式进行了初步的研究,冷激处理后 ChDHN 表现逐渐上调的表达趋势,24 h 达到最大表达量,48 h 表达量降低;推测 ChDHN 属于植物冷适应调节网络中的应答基因;定量 RT-PCR 分析 ChDHN在不同器官中的表达,在种子中高丰度表达,其次是雄花序和花芽,在树皮中表达最低。用 PCR、酶切和测序鉴定等方法检测已成功构建重组表达载体 pET-32a(+)-DHN,将鉴定完全正确的重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3),经 SDS-PAGE 分析并经过 Western blotting 鉴定,表明重组蛋白被 IPTG 诱导后高效表达出一条比预测分子量 18.03 kD 大 4 kD 的融合蛋白。
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利用AhMITE1转座子分子标记鉴定花生F_1代杂种
《花生学报 》 2012
摘要：对杂交后代进行杂种的真实性鉴定是杂交育种成功的前提。AhMITE1转座子标记是一类基于PCR的分子标记,其在花生中扩增的产物片段差异大,多态性强,采用琼脂糖凝胶电泳即可区分。本研究用7对多态性转座子引物对6个花生组合的166个F1单株进行了真实性鉴定。根据杂种植株含有父母本带型为依据共鉴定出了77个单株为真杂种,真杂种植株数占植株总数的比率为44.86%;收获时根据田间表型鉴定出了79个单株为真杂种,真杂种比率为47.59%。
关键词： 花生 杂种鉴定 分子标记 转座子 AhMITE1 PCR
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