猪TRIM56敲除细胞系的构建及在增殖PRRSV疫苗毒株中的应用

张秀婷; 吴香菊; 齐静; 丛晓燕; 李均同; 陈大全; 姜宁朋; 杜以军; 《畜牧与兽医 》 2023 北大核心

摘要：利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建 1 株猪TRIM56 基因敲除的PAM-KNU细胞系,并探究其在增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)疫苗毒株中的应用.根据猪TRIM56 基因组外显子区域设计合成2 对特定的向导RNA引物,将引物磷酸化、退火并连接至Px459M和EZ-Guide-XH载体构建敲除质粒Px459M-sTRIM56-KO;将敲除质粒转染PAM-KNU细胞,经嘌呤霉素筛选、有限稀释法筛选获得单克隆细胞并扩大培养;通过RT-PCR、测序及Western blot筛选鉴定,最终获得了敲除细胞系sTRIM56-KO-PAM-KNU;将PRRSV R98 疫苗株感染野生型细胞及敲除细胞系,利用real-time RT-PCR、半数组织培养感染量(TCID50)以及Western blot 检测PRRSV增殖情况.结果显示,TRIM56 敲除细胞系构建成功,该敲除细胞系中sTRIM56 基因编码区第 929~2120 位 1192 个碱基缺失,未检测到sTRIM56 蛋白条带;敲除细胞系中PRRSV R98 疫苗株病毒拷贝数、病毒滴度以及N蛋白表达均显著高于对照组.本研究为猪TRIM56 抗病毒机制研究及PRRSV疫苗研发奠定了基础.

关键词： 猪TRIM56基因 基因敲除 PAM-KNU细胞 猪繁殖与呼吸综合征病毒