科研产出
鸡传染性支气管炎病毒M41株的致病性及排毒规律
《中国兽医学报 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：本试验针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)呼吸型M41标准株的S1基因设计并合成引物,构建了阳性质粒标准品;经过不断优化建立了检测IBV-M41 SYBR GreenⅠReal-Time PCR标准曲线。通过对8日龄SPF鸡人工感染IBV-M41发病,采用Real-Time PCR方法跟踪检测其泄殖腔排毒情况;剖检并采集试验鸡的相关器官制作病理切片;在临床观察的基础上记录试验鸡的体质量、体温等指标。结果显示,所建立的检测方法重复性好,特异性高,最低可检测到28.3拷贝/μL的病毒核酸。人工感染病毒3～15 d后在鸡的排泄物中均检测到了病毒;攻毒组鸡临床症状明显,相关组织器官均呈现不同程度的病变。该病毒致病性试验、排毒规律和real-time PCR检测方法的建立,为IBV感染鸡作为实验动物模型进行相关药物的临床药效评价提供方法与依据。
关键词： real-time PCR 鸡传染性支气管炎病毒 IBV-M41 病理变化 排毒规律
全文链接
请求原文
IP-10作为牛结核病诊断标志物的初步探究
《中国兽药杂志 》 2018 北大核心
摘要：为评价细胞因子IL-12 p40、IP-10和TNF-α转录水平与牛分枝杆菌感染之间的关系,及其在牛结核病诊断中的应用潜力。采集田间筛选的结核病阳性牛、结核病阴性牛以及牛分枝杆菌68002人工感染牛的外周血淋巴细胞,经牛结核菌素(PPDB)、重组蛋白CFP-10-ESAT-6(CE)、MPT63、PET和PBS分别刺激6 h,提取细胞总RNA,用荧光定量PCR检测IL-12 p40、IP-10、IFN-γ和TNF-α的转录水平。结果显示结核病阳性牛的外周血淋巴细胞经PPDB和CE刺激后,其IP-10的m RNA转录水平显著高于结核病阴性牛,且与IFN-γ的m RNA转录水平具有良好的相关性;初步建立牛结核病IFN-γ和IP-10的Real-time PCR检测方法,其对临床阳性样本的检出率分别为71.45%和78.57%。因此,IP-10的m RNA转录水平与牛分枝杆菌的感染相关,有作为牛结核病诊断标志物的潜力。
关键词： 牛结核病 诊断 IP-10 IFN-γ Real-Time PCR
全文链接
请求原文
大灰象甲实时定量PCR内参基因的筛选
《昆虫学报 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：【目的】筛选出适合分析大灰象甲Sympiezomias velatus成虫不同组织中基因表达水平的内参基因。【方法】利用转录组测序技术获得大灰象甲管家基因序列作为候选内参基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析候选基因在大灰象甲雌雄成虫触角、头、胸、腹和足中的表达量;并利用geNorm, NormFinder和BestKeeper软件及在线工具RefFinder评价候选基因的表达稳定性。以大灰象甲气味结合蛋白1(odorant bindng protein 1, OBP1)基因为目标基因验证候选基因在大灰象甲成虫不同组织中的表达稳定性。【结果】基于大灰象甲转录组数据首次鉴定得到β-肌动蛋白基因(ACT)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、18S核糖体RNA基因(18S rRNA)、60S核糖体蛋白L12基因(RPL12)、60S核糖体蛋白L32基因(RPL32)、40S核糖体蛋白S20基因(RPS20)、延伸因子2基因(EF2)、α-微管蛋白基因(TUA)和β-微管蛋白基因(TUB)共9个管家基因序列。geNorm分析结果显示,RPL12和RPS20是最稳定表达的内参基因,而BestKeeper和NormFinder分析结果显示最稳定表达的内参基因分别是TUA和TUB。综合各分析方法得出9个候选基因中TUB,TUA,RPS20和RPL12是最稳定表达的内参基因,而18S rRNA,ACT和GAPDH这3个广泛应用的内参基因则表现出最低的表达稳定性。最后以OBP1为目标基因对稳定性不同的4个候选基因进行稳定性验证,发现以TUB和RPL12为内参基因,OBP1在成虫不同组织之间的表达模式基本一致;而以RPL32为内参基因,表达模式与应用TUB作为内参基因时稍有不同,使用18S rRNA作为内参基因得到的OBP1表达模式则与应用TUB作为内参基因时的完全不一致。【结论】TUB,TUA,RPS20和RPL12可以作为分析大灰象甲成虫不同组织中基因表达水平的内参基因,为后续基因表达研究奠定了基础。
关键词： 大灰象甲 实时定量PCR 内参基因 基因表达分析 表达稳定性
全文链接
请求原文
小麦春化作用相关基因的时空表达特性研究
《分子植物育种 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：为明确普通小麦春化基因的时空表达特性,以强冬性品种济麦19、冬性品种钱交麦、半冬性品种泰山1号、偏春性品种济麦20和春性品种中国春为实验材料,利用q RT-PCR技术,分析了VERNALIZATION1(Vrn1)、VERNALIZATION2(Vrn2)和VERNALIZATION3(Vrn3)的时空表达特性。结果表明在普通小麦中,Vrn1基因在四类小麦的表达量由高至低为幼穗、旗叶、普通叶片、茎秆。未春化时,冬性越强的品种,Vrn1、Vrn3基因的起始表达量越低,Vrn2基因的起始表达量越高。随着春化过程的进行,Vrn1和Vrn3基因上调表达,并在春化25 d时出现表达加速上调现象;Vrn2基因下调表达。小麦冬性越强,Vrn基因表达量变化越明显。在脱春化过程中,随着高温时间的增加,Vrn和Vrn3基因下调表达,Vrn2基因表达变化不明显。该结果为进一步分析普通小麦春化发育的分子调控机理提供了重要信息。
全文链接
请求原文
Real-Time PCR方法对IBV弱毒苗致弱分析
《山东农业科学 》 2015
摘要：在前期研究中,对QX基因型IBV分离株SDZB0808在SPF鸡胚连续传代前后毒株(P1和P100)进行全基因组测序。针对P1和P100毒株基因组的差异,设计特异性引物,利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量检测方法对其进行定量分析。结果显示:该野毒株强、弱基因并存,经鸡胚传代后,强毒毒株所占比例逐步下降,弱毒毒株所占比例逐步上升,相对值呈下降趋势,接近于零。从而推测:传染性支气管炎病毒致弱原因可能是鸡胚对弱毒基因的定向选择性筛选的结果。
关键词： 鸡传染性支气管炎 Real-Time PCR IBV弱毒苗 致弱
全文链接
请求原文
猪IL-10 SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测方法的建立
《家畜生态学报 》 2014 北大核心
摘要：白介素-10(IL-10)是一种具有免疫抑制作用的多能细胞因子.能够引发猪免疫抑制效应的多种病毒在感染宿主时均伴随有明显的IL-10上调,其中就包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),然而并不是所有的PRRSV毒株都能上调IL-10.为了详细探讨PRRSV免疫抑制与IL-10上调之间的关系以及PRRSV感染上调IL 10的具体分子机制,本研究针对猪IL-10以及看家基因β actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建了各自含有IL-10、βactin引物扩增序列的重组质粒为阳性标准品,建立了以2△△ct为基础的SYBR GreenⅠrealtime PCR检测方法.该方法线性关系良好;敏感性高,两种基因的检测下限均为1×101 copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性良好,批内变异系数小于2%,批间变异系数小于3%;目的基因及内参基因的扩增效率较高,分别为92.7%、97.8%.综上所述,该方法可以用于猪IL-10 mRNA水平的表达分析.
关键词： 猪 白介素-10 PRRSV 免疫抑制 Real-time PCR
全文链接
请求原文
猪IL-10 SYBR Green I Real-time PCR检测方法的建立
《家畜生态学报 》 2014 北大核心
摘要：白介素-10(IL-10)是一种具有免疫抑制作用的多能细胞因子。能够引发猪免疫抑制效应的多种病毒在感染宿主时均伴随有明显的IL-10上调,其中就包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),然而并不是所有的PRRSV毒株都能上调IL-10。为了详细探讨PRRSV免疫抑制与IL-10上调之间的关系以及PRRSV感染上调IL-10的具体分子机制,本研究针对猪IL-10以及看家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建了各自含有IL-10、β-actin引物扩增序列的重组质粒为阳性标准品,建立了以2-△△Ct为基础的SYBR GreenⅠrealtime PCR检测方法。该方法线性关系良好;敏感性高,两种基因的检测下限均为1×101copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性良好,批内变异系数小于2%,批间变异系数小于3%;目的基因及内参基因的扩增效率较高,分别为92.7%、97.8%。综上所述,该方法可以用于猪IL-10mRNA水平的表达分析。
关键词： 猪 白介素-10 PRRSV 免疫抑制 Real-time PCR
全文链接
请求原文
转基因抗虫玉米的定量检测
《中国农学通报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：建立高效、快速、准确的抗虫转基因玉米MIR162转化体特异性实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法。采用SYBR Green I和Taqman探针2种定量方法对抗虫转基因玉米MIR162进行了检测研究。SYBR Green I法MIR162转化体特异性片段和内标基因zSSIIb的熔解曲线均表现为单一峰,扩增特异性强;二者的扩增效率均在90%~100%之间,标准曲线相关系数R2均大于0.998。2种定量方法的检测限(LOD)均为24个拷贝,定量限(LOQ)为48个拷贝,灵敏度较高。重复测试结果表明,SYBR Green I法的标准偏差(SD)变化范围为0.05~0.13,相对标准偏差(RSD)范围为0.17%~0.40%,Taqman探针法的SD变化范围为0.03~0.14,RSD范围为0.11%~0.44%,说明2种定量检测方法具有良好的重复性和精密度。对MIR162含量为3%、1%和0.5%的混合样品的定量结果为:3.13%、1.09%、0.53%(SYBR Green I法)和3.07%、1.02%、0.50%(Taqman探针法),RSD均小于10%,T检验分析表明2种定量方法定值结果差异不显著。本研究建立的2种实时荧光定量PCR均可有效对转基因玉米MIR162进行定量检测,可根据不同实际需求及实验室条件进行选择相应的检测方法。
关键词： 转基因抗虫玉米 SYBR Green I Taqman real-time PCR
全文链接
请求原文
榛子甜菜碱醛脱氢酶基因BADH的克隆及在越冬过程中的表达特性分析
《山东农业科学 》 2013
摘要：甜菜碱是高等植物体内一种重要的渗透调节物,甜菜碱醛脱氢酶(Betaine aldehyde dehydrogen-ase,BADH)是甜菜碱合成的关键酶之一,本文基于Solexa技术对平榛花芽转录组测序结果的分析采用RACE-PCR技术克隆到一个平榛BADH基因,命名为ChBADH(HQ700873).ChBADH cDNA全长1 691 bp,具有一个1 512 bp的潜在编码区,编码503个氨基酸,预测其蛋白质相对分子量54.7 ku,理论等电点为5.44.Ch-BADH具有BADH家族保守的VSLELGGKSP功能活性位点和特征多肽序列,序列比较和生物信息学分析结果显示ChBADH在保守结构域和其他植物来源的BADH享有高度的一致性.以ACTIN为内参,对ChBADH基因在四个时期平榛的表达模式进行了初步的研究,荧光定量结果表明,ChBADH在寒冬时期被强烈的诱导表达,是非冷适应时期的3.5倍,推测该基因可能与榛子花芽越冬有紧密关系.
全文链接
请求原文
平榛脱水素基因的克隆与表达分析
《园艺学报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：以平榛(Corylus heterophylla Fisch.)花芽为试材,采用 RT-PCR 和 RACE 方法克隆了一个平榛与脱水素基因同源的 cDNA 基因,命名为 ChDHN(GenBank 登录号 HM228389),其全长 639 bp,具有一个 504 bp 的潜在编码区,编码 167 个氨基酸组成的多肽,具有 LEA 类家族成员具有的特征多肽序列,属于 Y4SK2类型 DHN 基因,预测 ChDHN 蛋白质分子量 18.03 kD,预测其理论等电点为 7.28。对ChDHN 的时空表达特性进行了研究,以 Actin 为内参,对 ChDHN 在 4 ℃冷激条件下(0、2、4、8、24和 48 h)的表达模式进行了初步的研究,冷激处理后 ChDHN 表现逐渐上调的表达趋势,24 h 达到最大表达量,48 h 表达量降低;推测 ChDHN 属于植物冷适应调节网络中的应答基因;定量 RT-PCR 分析 ChDHN在不同器官中的表达,在种子中高丰度表达,其次是雄花序和花芽,在树皮中表达最低。用 PCR、酶切和测序鉴定等方法检测已成功构建重组表达载体 pET-32a(+)-DHN,将鉴定完全正确的重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3),经 SDS-PAGE 分析并经过 Western blotting 鉴定,表明重组蛋白被 IPTG 诱导后高效表达出一条比预测分子量 18.03 kD 大 4 kD 的融合蛋白。
全文链接
请求原文
