科研产出
四种常见猪肠道病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用
《微生物学通报 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：【背景】猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）和猪轮状病毒（porcinerotavirus,PoRV）是当前导致猪群发生病毒性腹泻的4种主要病原，并且常发生混合感染。【目的】建立一种可鉴别诊断这4种腹泻病毒病的检测方法，对于临床诊断具有重要意义。【方法】针对PEDV的M蛋白基因、TGEV的N蛋白基因、PDCoV的N蛋白基因和PoRV的VP7蛋白基因分别设计特异性引物，进而构建相应的重组质粒标准品。通过对PCR反应条件优化，建立可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的多重RT-PCR检测方法。随后通过敏感性、特异性和重复性试验对该方法的有效性进行验证。【结果】敏感性试验结果显示，对PEDV-M、TGEV-N、PDCoV-N和PoRV-VP7重组质粒标准品的最低检测下限分别为1.75×10~2、1.5×10~3、1.6×10~2和1.6×10~2copies/μL；特异性试验结果显示，仅可检出本研究中的4种靶病毒，而猪群常见病毒CSFV、PRRSV、PCV2和PRV未能检出。重复性试验结果显示，选取10~8、10~6和10~4copies/μL3个不同浓度的重组质粒作为模板，其他条件不变，分别进行5次重复试验，5次试验均扩增出清晰、均匀的条带。对山东各地区送检的52份临床腹泻样品通过建立的四重RT-PCR方法进行检测，发现PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的阳性率分别为37%（19份）、6%（3份）、10%（5份）和25%（13份）。其中PEDV和PoRV混合感染2份（4%）,PEDV和TGEV混合感染2份（4%）,PEDV和PDCoV混合感染1份（2%）。通过单重RT-PCR对该多重RT-PCR临床样品检测结果进行重复验证，结果显示多重RT-PCR与常规单重RT-PCR结果符合率为100%。最后随机挑选5个检测为阳性的临床样本进行测序验证，结果均为相应病毒的基因片段。【结论】本研究建立了可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的四重RT-PCR检测方法，研究结果为临床4种猪腹泻病毒病的鉴别诊断及流行病学调查提供了技术手段。
关键词： 多重RT-PCR 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪δ冠状病毒 猪轮状病毒
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牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛肠道病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用
《中国兽医学报 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：根椐GenBank中已发表中病毒性腹泻病毒(BVDV)、中冠状病毒(BCoV)和中肠道病毒(BEV)基因的保守序列,设计合成引物,在建立单一病毒RT-PCR检测方法的基础上,继续优化条件,建立上述3种病毒的多重RT-PCR检测方法,并应用建立的检测方法对临床样本进行检测,计算符合率。结果表明,引物浓度分别为BVDV 0.5μL(20μmol/L),BCoV 0.25μL(20μmol/L),BEV 0.25μL(20μmol/L),退火温度为52℃时,可同时扩增BVDV的289bp,BCoV的458bp和BEV的732bp的特异性片段,对牛流行热病毒(BEFV)、牛轮状病毒(BRV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)均无扩增。该方法最低能检出6.4pg的BVDV,1.28pg的BCoV和6.4pg的BEV的等量混合质粒模板。对24份临床腹泻病料进行检测,与单项RT-PCR检测的符合率为100.0%。本研究建立的多重RT-PCR检测方法,具有准确、快速、特异的特点,可用于临床混合感染的同时检测。
关键词： 多重RT-PCR 牛病毒性腹泻病毒 牛冠状病毒 牛肠道病毒
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甜樱桃病毒病分子检测技术的研究
《果树学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：【目的】建立简便、快速、高效、准确的甜樱桃病毒分子检测方法。【方法】根据我国甜樱桃病毒病害的发生特点,先后建立和完善了几种主要病毒的单重RT-PCR、多重RT-PCR、纳米磁珠技术结合多重RT-PCR的检测方法,并对各检测方法的适用范围、检测效率进行比较分析。【结果】改进后的单重RT-PCR方法利用随机引物反转录得到的c DNA模板可同时用于多种病毒的特异性检测。多重RT-PCR方法可在同一管PCR反应中同时检测多种病毒。运用纳米磁珠技术结合多重RT-PCR的检测方法在植物病毒核酸提取环节简化了操作程序。【结论】该检测技术体系已应用于山东地区甜樱桃及中国樱桃等大批量植物样本的病毒检测工作之中,检测结果稳定、可靠。
关键词： 甜樱桃 病毒 检测 RT-PCR 多重RT-PCR 纳米磁珠
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3种甜樱桃病毒PNRSV、PDV及LChV-2的多重RT-PCR检测方法的建立与应用
《中国农业科学 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：【目的】建立可同时检测李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf virus,PDV)、樱桃小果病毒2(Little cherry virus-2,LChV-2)的多重RT-PCR检测方法。【方法】以复合感染3种病毒的甜樱桃病株叶片为材料,采用CTAB法提取样本总RNA,选用随机六聚体引物对植物样本总RNA进行反转录,所得cDNA作为多重RT-PCR的扩增模板。根据GenBank中PNRSV、PDV、LChV-2基因组序列共设计6对特异引物,分别通过单一RT-PCR和多重RT-PCR筛选出可用于同时检测3种甜樱桃病毒的引物组合。对多重RT-PCR的退火温度及循环数进行优化,以筛选出各引物组合的最适扩增条件。分别以单一感染PNRSV、PDV、LChV-2、复合感染3种病毒、单一感染樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)及甜樱桃无毒苗为样本,对多重RT-PCR引物的特异性进行分析。选取复合感染3种病毒的甜樱桃总RNA的反转录产物为初始模板,按照梯度稀释法依次将模板稀释为2、22、23、24、25倍,在相同PCR反应体系及反应条件下分别对各引物组合的灵敏度进行分析。多重RT-PCR的扩增条带经凝胶回收试剂盒回收纯化后连接至pMD18-T vector,克隆测序,以验证多重RT-PCR检测的准确性。并应用该方法对山东泰安地区甜樱桃生产园中间隔栽培的中国樱桃进行检测。【结果】筛选到2个可以应用的引物组合,组合1"PNRSV-S1/A1、PDV-S2/A2、LChV2-S1/A1"可分别特异性地扩增733、467、337 bp的片段。组合2"PNRSV-S1/A1、PDV-S3/A3、LChV2-S1/A1"可分别扩增得到733、265、337 bp的片段。扩增产物大小与预期相符。多重RT-PCR反应条件优化结果显示,在退火温度52℃、35个循环条件下,2个引物组合的检测效果均较为理想。特异性分析结果显示,2个引物组合均能特异性检测其各自的靶病毒。灵敏度分析结果显示,2个引物组合在cDNA的23×稀释液中仍能特异性扩增,但扩增条带的强度稍有差异,其对植物总RNA的反转录产物的最低检测浓度为107.9 ng·μL-1。克隆测序及序列分析表明,2个引物组合对各自靶病毒的检测结果可靠。应用该方法对9个中国樱桃样本进行检测,结果显示,测试样品均至少感染了2种病毒,其中5个样品复合感染了3种病毒,2个样品同时感染PDV和LChV-2,2个样品同时感染PNRSV和LChV-2。【结论】应用建立的多重RT-PCR检测方法可稳定、准确、灵敏的同时检测单一或复合侵染的3种甜樱桃病毒。
关键词： 李属坏死环斑病毒 李矮缩病毒 樱桃小果病毒-2 多重RT-PCR 病原检测
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